【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，特別是涉及slc35e2b在hacat細胞模型構建中的應用。
技術介紹
1、銀屑病是一種表現為紅斑、斑塊、鱗屑的慢性炎癥性皮膚病，在關于銀屑病的遺傳學研究過程中，不少研究提示銀屑病與其他疾病(如糖尿病、克羅恩病、類風濕性關節炎等)存在共同的遺傳學基礎。研究發現銀屑病的一些易感基因，如cdkal1、psors2、psors3、psors4、il12b、il23a及il23r等，這些基因均被發現同時也與2型糖尿病存在關聯。
2、溶質轉運載體35(solute?carrier?35，slc35)是slc家族中的第35個成員，分為7個亞型(a-g)，是一種由300～400個氨基酸組成的疏水性蛋白質。slc35多數成員定位在高爾基復合體膜上，另有一小部分定位在細胞膜上，主要轉運細胞內的相應單糖核苷酸并保證糖基化過程的順利進行，slc35被認為是糖基化途徑中的關鍵調節因子。
3、目前有關slc35e2b的研究甚少，其功能尚不清楚。根據前期研究結果，為進一步探討slc35e2b對斑塊型銀屑病的影響和可能的機制，本課題組分別通過沉默或過表達slc35e2b基因建立體外培養的hacat細胞模型，探索slc35e2b基因對角質形成細胞增殖、凋亡、分化和炎癥因子分泌的影響。該研究對探究slc35e2b在角質形成細胞的作用、相關機制及可能參與的分子通路有重要意義，同時為指導銀屑病的治療提供新的理論依據，具備一定經濟效益和社會效益。
技術實現思路
1、本專利技術的
2、為解決上述技術問題，實現上述目的，本專利技術通過如下技術方案予以實現：
3、本課題組前期對753例銀屑病患者進行了相關統計，發現其中糖尿病的發生率明顯升高。為了探究銀屑病與糖尿病之間更多的共享易感基因，通過全外顯子基因測序法對47例銀屑病患者及14例健康對照全血進行差異基因檢測，結果從多個相關的基因中發現了slc35e2b基因位點突變。我們進一步通過免疫組化發現slc35e2b表達定位于表皮層角質形成細胞，并且在斑塊型銀屑病患者中低表達。
4、沉默或過表達slc35e2b基因的hacat細胞模型構建方法，其分別基于sirna誘導基因沉默和慢病毒介導基因過表達技術實現。
5、沉默slc35e2b基因的hacat細胞模型構建方法，包括如下步驟：
6、1.設計sirna引物序列：根據slc35e2b基因的信息及實驗要求，根據引物設計的原則，利用primer&oligo軟件選取引物序列，然后合成引物。
7、2.選擇最優sirna引物序列：通過預實驗結果并結合擴增溶解曲線選擇最優的引物進行正式實驗。
8、3.設計引物序列：在genbank平臺查詢slc35e2b基因引物序列，通過pubmed的primer?blast驗證后，選取合適序列，合成所需引物。
9、4.轉染：通過轉染hacat細胞獲得slc35e2b基因沉默的hacat細胞。
10、過表達slc35e2b基因的hacat細胞模型構建方法，包括如下步驟：
11、1.構建慢病毒表達載體：確定物種及選擇目的基因序列的慢病毒表達載體，根據slc35e2b基因的信息及實驗要求，在genbank平臺查詢slc35e2b基因序列，基因名稱(ensembl)：ensmusg00000019731，敲除基因genbank編碼：nm_177766.3；驗證并合成目的基因，然后構建慢病毒表達載體。
12、2.預實驗：摸索最佳感染復數(multiplicity?of?infection,moi)，確定每個細胞加入的病毒數。
13、3.感染hacat細胞：通過腺病毒介導hacat細胞slc35e2b基因過表達。
14、與現有技術相比，本專利技術具有的有益效果為：
15、本專利技術主要基于sirna誘導基因沉默技術和慢病毒介導基因過表達技術建立沉默或過表達slc35e2b基因的hacat細胞體外培養模型，模型構建成功后經rt-pcr方法檢測比較slc35e2b基因的表達水平，在此基礎上可進一步探索slc35e2b基因對角質形成細胞增殖、凋亡、分化和炎癥因子分泌的影響。同時，為研究slc35e2b基因通過影響角質形成細胞從而在銀屑病發病機制及可能參與的分子通路提供主要的細胞實驗材料。
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1.SLC35E2B在銀屑病研究的Hacat細胞模型構建中的應用。
2.沉默SLC35E2B的Hacat細胞模型構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，SiRNA引物序列如下：
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，轉錄引物序列：
5.SLC35E2B過表達的Hacat細胞模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.用于沉默SLC35E2B基因的SiRNA，其特征在于，SiRNA引物序列如下：
【技術特征摘要】
1.slc35e2b在銀屑病研究的hacat細胞模型構建中的應用。
2.沉默slc35e2b的hacat細胞模型構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，sirna引物序列如下：
【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉華，蘇艷文，蔄茂強，林秀球，
申請(專利權)人：南方醫科大學皮膚病醫院廣東省皮膚病醫院，廣東省皮膚性病防治中心，中國麻風防治研究中心，
類型：發明
國別省市：
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