【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學，尤其涉及農藥的微生物降解，具體是一種異丙威水解酶基因片段cehar-7。
技術介紹
1、隨著經濟全球化的快速發展，人們對農產品的需求也在日益增多，相對應的農產品的發展也越來越快，殺蟲劑是保障農產品正常生長的農藥之一，也被更多的應用，但是殺蟲劑的殘留會對人體以及環境帶來巨大的危害。自19世紀70年代以來，有機農藥基于其滅殺效率高毒性大且分解難度大的特點，一方面被不同國家禁用或者限制使用，另一方面被廣泛的開發應用，氨基甲酸酯類農藥就是其中之一。氨基甲酸酯類農藥是在有機磷酸酯之后發展起來的合成農藥，是一種新型廣譜的殺蟲、殺螨劑，屬于膽堿酯酶抑制劑，也是一種內分泌干擾劑。異丙威是氨基甲酸酯類農藥中使用量較多的殺蟲劑，具有較強的觸殺自效果，對稻飛虱和葉蟬科害蟲有特效。人們通過大量噴灑異丙威來保障水稻產量，但是長期大量的使用異丙威，也逐步加深了環境中的農藥殘留，這將嚴重危害動物和人們的身體健康，甚至將帶來癌癥、畸形和內分泌紊亂等嚴重疾病。
2、大量研究表明，異丙威在環境中消解的主要因素是微生物降解，目前國內外分離到多株異丙威降解菌株，但是關于異丙威降解的關鍵酶的報道較少，只有來自菌株rhodococcus?sp.d-6的異丙威水解酶ipch。據報道，同屬于氨基甲酸酯類農藥的初始降解酶都是水解酶，最早關于氨基甲酸酯類農藥的水解酶是關于呋喃丹水解酶基因，tomaseek在菌株achromobactersp.wm111中一個大型質粒上發現呋喃丹水解酶基因mcd，隨后hashimoto等人于2002年從菌株rh
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，本專利技術提出了一種異丙威水解酶基因cehar-7及其應用，能夠有效的水解異丙威，可用于修復土壤、水體，降解環境中殘留的殺蟲劑異丙威。
2、本專利技術要解決的技術問題是通過以下技術方案實現的：
3、一種異丙威水解酶基因cehar-7，其核苷酸序列為以下任一：
4、(1)序列表seq?id?no.1的dna序列；
5、(2)序列表seq?id?no.2的氨基酸序列；
6、(3)與氨基甲酸酯類農藥水解酶ceha同源性90％以上的序列，優選為99％以上的同源性。
7、一種異丙威水解酶cehar-7，該水解酶的氨基酸序列為序列表seq?id?no.2的氨基酸序列。
8、一種異丙威水解酶cehar-7的制備方法，是將上述的異丙威水解酶基因cehar-7克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的異丙威水解酶cehar-7。
9、其中，所述的表達載體為pet-24b(+)質粒，購自novegen公司。
10、其中，所述的宿主細胞為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)，購自上海英駿生物技術有限公司。
11、進一步的，所述的重組表達載體，是將異丙威水解酶基因cehar-7插入pet-24b(+)的nde?i和xho?i位點之間獲得。
12、進一步的，所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的pcr擴增，pcr擴增分別采用了正向引物和反向引物，其中正向引物的如序列表seq?id?no.3所示，反向引物如序列表seq?id?no.4所示。
13、進一步的，所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的表達和純化，異丙威水解酶基因在iptg誘導下表達異丙威水解酶，再通過ni2+-nta親和層析純化異丙威水解酶。
14、基于上述的異丙威水解酶基因cehar-7，可應用于通過基因導入構建，制備出提高對異丙威的耐受性的轉基因作物。
15、基于上述的異丙威水解酶cehar-7，其酶或酶制劑可應用于降解環境中的異丙威，修復土壤和水體中的異丙威污染。
16、與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：本專利技術獲得的異丙威水解酶cehar-7，能水解異丙威生成鄰異丙基苯酚，可用于制備酶制劑用于修復土壤、水體，降解環境中殘留的殺蟲劑異丙威。
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1.一種異丙威水解酶基因cehAR-7，其特征在于：核苷酸序列為以下任一：
2.一種異丙威水解酶CehAR-7，其特征在于：該水解酶的氨基酸序列為序列表SEQ?IDNO.2的氨基酸序列。
3.一種異丙威水解酶CehAR-7的制備方法，其特征在于：是將上述的異丙威水解酶基因cehAR-7克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的異丙威水解酶CehAR-7。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的表達載體為pET-24b(+)質粒，購自Novegen公司，所述的宿主細胞為大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)，購自上海英駿生物技術有限公司。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的重組表達載體，是將異丙威水解酶基因cehAR-7插入pET-24b(+)的Nde?I和Xho?I位點之間獲得。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的PCR擴增，PCR擴增分別采用了正向引物和反向引物，其中正向引物的如序列表SEQID?NO.3所示，反向引物如序列表SE
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的表達和純化，異丙威水解酶基因在IPTG誘導下表達異丙威水解酶，再通過Ni2+-NTA親和層析純化異丙威水解酶。
8.一種異丙威污染環境的修復方法，其特征在于，所述方法包括使用權利要求2中的酶或酶制劑降解環境中殘留的異丙威。
9.一種轉基因作物，其特征在于，所述作物通過將權利要求1中的基因導入構建，以提高對異丙威的耐受性。
10.一種異丙威水解酶CehAR-7的應用，其特征在于，所述應用包括：
...【技術特征摘要】
1.一種異丙威水解酶基因cehar-7，其特征在于：核苷酸序列為以下任一：
2.一種異丙威水解酶cehar-7，其特征在于：該水解酶的氨基酸序列為序列表seq?idno.2的氨基酸序列。
3.一種異丙威水解酶cehar-7的制備方法，其特征在于：是將上述的異丙威水解酶基因cehar-7克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的異丙威水解酶cehar-7。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的表達載體為pet-24b(+)質粒，購自novegen公司，所述的宿主細胞為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)，購自上海英駿生物技術有限公司。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的重組表達載體，是將異丙威水解酶基因cehar-7插入pet-24b(+)的nde?i和xho?i位點之間獲得...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李娜，吳靜，楊迎新，王博含，高奧，
申請(專利權)人：南陽師范學院，
類型：發明
國別省市：
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