【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗體，尤其涉及一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的重組基因xbp1-bip及表達載體、提高抗體表達量的重組細胞及其應用。
技術介紹
0、技術背景
1、生物制藥的工業制造過程高度依賴細胞表達平臺，最大限度地提高生產產量、降低相關成本。因此，開發和實施新的策略，以實現高產的哺乳動物細胞表達是非常必要的。freestyle?293f細胞系由來源于親本?293-f?細胞（經有限稀釋進行重新克隆）的低代數主細胞庫培養物制備，該細胞作為哺乳動物宿主細胞，優勢在于：（ⅰ）易于轉染，具有良好的耐受性和高轉染效率；（ⅱ）生長特性良好，能夠懸浮生長，這對于大規模工業生產非常有利；（ⅲ）能夠產生非常高水平的蛋白質；（ⅳ）在培養體系中能夠快速增長，高密度培養。
2、在過去的十年中，各種成功的轉錄和翻譯工程策略已經顯著的推動了哺乳動物細胞生產力。目前，翻譯后能力的限制一直被認為是阻止哺乳動物細胞在生物制藥生產場景中充分開發其生理生產能力的主要瓶頸。
3、當b細胞分化為漿細胞時，它們失去了大部分b細胞特征的表達，并發生自由基重組使它們能夠分泌大量的蛋白質免疫球蛋白(ig)。漿細胞分化有兩種必需的轉錄調節因子：由prdm1基因編碼的轉錄抑制因子blimp-1和a?b-zip家族轉錄激活因子xbp1。xbp1作用于blimp-1的下游，xbp1s是內質網upr中肌醇需求酶1(ire1)/xbp1信號通路的關鍵因子，能夠誘導分子伴侶和內質網蛋白降解途徑中相關蛋白的表達。可見xbp1是b細胞分化為分泌免疫球蛋白的
4、結合免疫球蛋白(binding?immunoglobulin?protein，bip)，又稱hspas，是位于內質網(endoplasmie?retieulum，er)的重要分子伴侶，屬于熱休克蛋白(hsp70)家族成員之一，也稱為grp78，是一種內質網駐留蛋白，能夠與許多不完全折疊和未組裝的蛋白結合。對于許多分泌或膜結合蛋白，其與bip的結合是瞬時的；而對于折疊錯誤、糖基化不當或其他分泌不足的蛋白質，其與bip的結合可以更穩定。bip作為內質網伴侶在內質網腔內蛋白質折疊和質量控制中起關鍵作用。
5、高效生物工藝策略的開發對于具有治療和預防意義的重組蛋白的工業生產至關重要，用作治療藥物、疫苗和診斷試劑等領域的重組蛋白主要使用原核和真核表達宿主系統（例如哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆蟲細胞和轉基因植物）在實驗室規模和大規模環境中生產。對于一些結構復雜、功能依賴于哺乳動物特有的翻譯后修飾（如正確的糖基化、磷酸化等）的重組蛋白藥物，哺乳動物細胞培養是主要的生產方法。然而，哺乳動物細胞培養成本較高，生產周期較長，技術要求也相對較高。因此，在工業化生產中，篩選出產量高且穩定性強的細胞株，可以作為重組蛋白瞬時表達體系的宿主細胞，能夠有效提升抗體表達量，同時顯著降低成本，這對企業來說是極為迫切且有重要意義的。
6、freestyle?293由于易于轉染，可用于瞬時基因表達（transient?geneexpression,?tge）。相比于穩定表達系統，瞬時表達系統能夠在短時間內產生目標蛋白，能極大地提高工作效率，降低成本；并且，瞬時表達系統中的外源基因一般不會整合到宿主細胞的基因組中，減少了對宿主細胞基因組穩定性的潛在影響，降低了因基因整合可能導致的細胞癌變或者其他不良表型的風險，提高了生產過程的安全性和可靠性。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是：當前基于哺乳動物細胞構建的抗體表達系統不僅構建過程復雜，培養成本高，表達抗體產量有限，而且在長期傳代培養過程中，基因組容易發生突變、缺失、重排等遺傳變異，影響抗體的產量和質量。
2、為解決該技術問題，本專利技術提供一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的重組基因xbp1-bip及表達載體、提高抗體表達量的重組細胞及其應用。
3、本專利技術的目的是通過以下述方式實現的：
4、一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的重組基因xbp1-bip，所述重組基因xbp1-bip是將經過密碼子優化的xbp1和bip的基因序列通過ires元件連接得到；所述重組基因xbp1-bip的核苷酸序列如seq?id?no?:?5所示。
5、一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的表達載體，所述表達載體是將如seqid?no?:?5所示的核苷酸序列克隆至質粒載體plvx-ires-puro中得到。
6、所述的表達載體的構建方法，包括以下步驟：
7、（1）合成目的基因：人工合成核苷酸序列如seq?id?no?:?5所示；
8、（2）構建基因表達載體：將如seq?id?no?:?5所示的核苷酸序列通過ecor1/xbai酶切位點插入質粒載體plvx-ires-puro中，得到表達載體xb-plvx-ires-puro。
9、一種用于提高抗體表達量的重組細胞，所述重組細胞含有權利要求2所述的表達載體。
10、一種用于提高抗體表達量的重組細胞的構建方法，包括以下步驟：
11、（1）hek?293t貼壁細胞慢病毒包裝
12、轉染前1天，胰酶消化hek?293t細胞，以密度為5×10^5cells/ml鋪6?cm平皿，細胞鋪板在5mldmem完全培養基中；轉染當天，細胞匯合度達到80%-90%，使用pei轉染試劑，將表達載體xb-plvx-ires-puro配合用于包裝的質粒pspax2、pmd2g，按照4:3:1的體積整合到hek?293t細胞中；
13、（2）嘌呤霉素篩選細胞株
14、轉染48?h后，4000?rpm，4℃離心10min，收集細胞上清病毒液；將freestyle?293f懸浮細胞接種至6孔板，細胞接種量為1×106cells/孔；病毒液感染提前培養好的freestyle?293f懸浮細胞；感染3天后，分別用2?μg/ml、3?μg/ml、4?μg/ml和5?μg/ml的嘌呤霉素篩選液進行加壓篩選，每2-3天換液加藥，觀察細胞生長狀態，確定細胞株最大耐藥壓為4?μg/ml左右；使用4?μg/ml?puromycin加壓篩選，得到穩定細胞池；
15、（3）單克隆細胞株篩選
16、待細胞穩定后，通過有限稀釋法采用3?μg/ml?puromycin加壓篩選單克隆細胞，96孔板鋪板后，通過單克隆成像儀確定單克隆細胞株，得到可同時表達xbp1和bip的重組細胞293-xb；通過24孔板，6孔板的逐級篩選，確定生長狀態最優的單克隆細胞株及時凍存且同步進行結果驗證。
17、一種用于提高抗體表達量的重組細胞293-xb的應用，所述重組細胞293-xb是通過權利要求1-5任一項所述方法獲得，所述應用包括以下步驟：
18、（1）選取目的抗體，構建ppt5瞬時表達載體；...
【技術保護點】
1.一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的重組基因XBP1-BIP，其特征在于，所述重組基因XBP1-BIP是將經過密碼子優化的XBP1和BIP的基因序列通過IRES元件連接得到；所述重組基因XBP1-BIP的核苷酸序列如SEQ?ID?No?:?5所示。
2.一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的表達載體，其特征在于，所述表達載體是將如SEQ?ID?No?:?5所示的核苷酸序列克隆至質粒載體pLVX-IRES-puro中得到。
3.如權利要求2所述的表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.一種用于提高抗體表達量的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞含有權利要求2所述的表達載體。
5.如權利要求4所述的一種用于提高抗體表達量的重組細胞的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.一種用于提高抗體表達量的重組細胞293-XB的應用，其特征在于，所述重組細胞293-XB是通過權利要求1-5任一項所述方法獲得，所述應用包括以下步驟：
【技術特征摘要】
1.一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的重組基因xbp1-bip，其特征在于，所述重組基因xbp1-bip是將經過密碼子優化的xbp1和bip的基因序列通過ires元件連接得到；所述重組基因xbp1-bip的核苷酸序列如seq?id?no?:?5所示。
2.一種用于構建提高抗體表達量的重組細胞的表達載體，其特征在于，所述表達載體是將如seq?id?no?:?5所示的核苷酸序列克隆至質粒載體plvx-ires-puro中得到。
<...【專利技術屬性】
技術研發人員：趙毅，趙澤，楊陽，陳星，
申請(專利權)人：鄭州大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：
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