結核分歧桿菌復合群的免疫檢出方法技術

通過在生物樣品中特異性檢出結核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白ＭＰＴ６４抗原，來比以前更快速、安全和準確地進行結核分歧桿菌感染的診斷。獲得識別位于ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯＳ：２－４的任一氨基酸序列的ＭＰＢ６４的抗原表位的抗體，特別是單克隆抗體。因此，提供使用該抗體的免疫測定方法，特別是使用抗ＭＰＢ６４的第一抗體和第二抗體的夾心免疫測定方法，特別是免疫色譜測定方法和免疫色譜測試條。試樣在未經生物樣品培養或短暫生物樣品培養（其中樣品中的結核分歧桿菌復合群未實質上增殖）后的情況下，能夠快速地進行試樣的免疫測定。生物樣品可以通過結核分歧桿菌的滅活處理或者分散或增溶化處理來進行預處理。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用結核分歧桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex) 特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫檢出方法，并且更具體地涉及夾心免疫測定方法，特 別是免疫色譜測定方法和免疫色譜測試條(test strip)。本專利技術涉及檢出方法，該方法對 于通過高靈敏度特異地檢出結核分歧桿菌復合群來快速、安全和高準度診斷結核分歧桿菌 復合群感染是有用的。
技術介紹
MPB64是由牛分歧桿菌BCG (Mycobacterium bovis BCG)產生并分泌到細菌細胞外 的分枝桿菌蛋白。另外，MPT64作為由結核分歧桿菌特異性產生并分泌到細菌細胞外的分 枝桿菌蛋白之一為人們所知。已知MPT64是與MPB64相同的物質。這意味著MPB64的抗體 也是MPT64的抗體。因此，通過培養病原性無害牛分歧桿菌BCG、提取并純化培養物中產生的MPB64， 利用MPB64作為抗原獲得抗MPB64抗體，并使用該抗體通過抗原-抗體反應(免疫反應) 檢出樣品中的MPT64，能夠診斷結核分歧桿菌復合群感染。已知有利用MPB64的抗體(以下，簡寫為“抗MPB64抗體”)通過免疫方法檢出結 核分歧桿菌的方法(參見專利文獻1)。另外，作為免疫方法還已知使用免疫色譜的測定方 法(參見專利文獻2)。然而，這些已知方法需要在進行免疫測定前，通過培養來增殖樣品中的結核分歧 桿菌復合群以分泌MPT64，該培養需要大約一周。另外，即使常規免疫色譜方法與大多數非結核性分枝桿菌(NTB)沒有反應性，只 與結核分歧桿菌復合群具有非常強的反應性，已報道它們仍顯示與兩株非結核性分枝桿菌 艮口，海分歧桿菌(Mycobacterium marinum)禾口苦參分歧桿菌(Mycobacterium flavescens) 的交叉反應性(非專利文獻1)。專利文獻1 日本專利特開平07-110332專利文獻2 日本專利特開平11-108931非專禾丨J文獻 1 =ABE C.等，"Simple and Rapid Identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex by Immunochromatographic Assay Using Anti-MPB64 Monoclonal Antibodies", Journal of Clinical Microbiology, 1999 11 月，第 3693-3697 頁。
技術實現思路
專利技術要解決的問題本專利技術的目的是特異性檢出生物試樣中的MPT64抗原，從而能夠以比以前更高的 準確度進行結核分歧桿菌復合群感染的診斷。另外，本專利技術另外的目的是以高靈敏度檢出生物試樣中的MPT64抗原，從而在未經培養或在樣品中的結核分歧桿菌復合群細菌實質上開始增殖之前培養一段時間后的情 況下，能夠對生物試樣進行免疫測定，并能夠比以前更快速和安全地進行結核分歧桿菌復 合群感染的診斷。用于解決問題的方案本專利技術人通過將MPB64作為免疫原免疫小鼠，已成功獲得MPB64的特異性抗原表 位的抗體，并發現在免疫測定，特別在夾心免疫測定，尤其在免疫色譜測定中，使用上述抗 體能夠更特異地以比以前更高的靈敏度檢出結核分歧桿菌復合群。由此，完成了本專利技術。即，根據本專利技術的一方面，提供檢出結核分歧桿菌復合群的方法，該方法包括使用 結核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的抗體的免疫測定，其中所述抗體包括位于 SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗體。并不特別限定用于本檢出方法的免疫測定，但是優選夾心免疫測定法、特別是 ELISA(酶聯免疫吸附測定)法和免疫色譜測定法等。因此，根據本專利技術的另一方面，提供檢出結核分歧桿菌復合群的方法，該方法包括 使用結核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的第一和第二抗體的夾心免疫測定，其中 第一和第二抗體的至少之一包括位于SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表 位的抗體。另外，根據本專利技術的優選實施方案，提供用于檢出結核分歧桿菌復合群的免疫色 譜測定方法，該方法包括提供膜載體，該膜載體具有在其預定位置通過固定化結核分歧桿菌復合群特異性 分泌蛋白MPB64的第一抗體形成的捕獲區(capturing zone)；和在膜載體上向捕獲區色譜展開含有MPB64的第二抗體和預定量試樣的混合溶液，由此，在捕獲區捕獲包含于試樣的抗原和第二抗體的復合體，并且其中第一和第 二抗體的至少之一包括位于SEQ IDNOS 2-4的任一氨基酸序列的MPB64抗原表位的抗體。另外，根據本專利技術的優選實施方案，提供用于檢出結核分歧桿菌復合群的免疫色 譜測試條，該免疫色譜測試條至少包括結核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白MPB64的第一 和第二抗體以及膜載體，其中第一抗體被預先固定化至膜載體的預定位置而形成捕獲區， 并且用適當的標記劑來標記和在遠離捕獲區的位置來制備第二抗體，以便在膜載體中色 譜展開，其中第一和第二抗體的至少之一包括位于SEQ ID NOS :2-4的任一氨基酸序列的 MPB64抗原表位的抗體。本專利技術中必不可少使用的MPB64的抗體是位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的抗體，可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并且從反應特異性角度來說， 優選單克隆抗體。同時，SEQ ID NOS :2-4的氨基酸序列構成示于SEQ ID N0:1的MPB64整 個氨基酸序列的部分，并且是包含MPB64抗原表位的區域。在夾心免疫測定如免疫色譜測定的情況中，此處所用的第一和第二抗體可分別是 多克隆或單克隆的，從反應特異性的觀點來看，通常優選至少兩種抗體之一為單克隆的，并 特別優選兩種抗體都是單克隆的。另外，由于MPB64是單體蛋白，所以優選第一和第二抗體 是MPB64不同抗原表位的抗體。本專利技術使用的抗體是位于SEQ ID NOS :2_4的任一氨基酸序列的抗原表位的抗體， 其中SEQ ID NOS 2-4的任一氨基酸序列包含于SEQ ID NO 1所示的MPB64的整個氨基酸序列中，因此，該抗體與MPB64或MPT64特異性反應。另外，本專利技術的這些抗體與非結核性 分枝桿菌(NTB)不反應，并進一步與海分歧桿菌和苦參分歧桿菌不反應，因此特異性優異。 SEQ ID N0S:2-4的氨基酸序列是包含MPB64抗原表位的區域。換言之，本專利技術使用的抗體 可以是與包含SEQ ID NOS 2-4的氨基酸序列之一的具有12-15個氨基酸殘基的MPB64片 段進行抗原_抗體反應的抗體。因此，根據本專利技術的另一方面，提供識別位于SEQ IDNOS 2~4的任一氨基酸序列 的MPB64抗原表位的單克隆抗體。專利技術的效果根據本專利技術，將位于SEQ ID NOS :2_4(所述SEQ ID NOS :2_4氨基酸序列包含于 SEQ ID N0:1所示的MPB64的整個氨基酸序列中)的任一氨基酸序列的抗原表位的抗體用 于免疫測定的檢出方法中，因此能夠以比以前更高的準確度進行結核分歧桿菌復合群感染 的診斷，并且由于在未經培養或在樣品中的結核分歧桿菌復合群細菌實質上開始增殖之前 培養一段時間后的情況下，也能將生物樣品進行免疫測本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢出結核分歧桿菌復合群的方法，其包括利用結核分歧桿菌復合群特異性分泌蛋白ＭＰＢ６４的抗體的免疫測定，其中所述抗體包括位于ＳＥＱＩＤＮＯＳ：２－４的任一氨基酸序列的ＭＰＢ６４的抗原表位的抗體。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：難波靖治，
申請(專利權)人：株式會社比爾生命，
類型：發明
國別省市：JP[日本]