本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種木霉孢子粉劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)木霉孢子粉劑包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株Ｔ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ Ｔ１，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為ＣＧＭＣＣ ＮＯ：３５３１）的孢子粉，其ｒＤＮＡ ＩＴＳ區(qū)片段序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示，所述助干劑為β－環(huán)糊精、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明專利技術(shù)木霉孢子粉劑可以對香蕉枯萎病起到有效防治的效果，還可以拮抗多種病原真菌，尤其對土傳真菌有顯著的拮抗效果。本發(fā)明專利技術(shù)制備方法節(jié)省了木霉孢子粉劑的制備時間，得到的木霉孢子粉劑密度大、萌發(fā)率高，干燥效率高，便于貯藏、運輸和使用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物活性農(nóng)藥粉劑，具體涉及一種木霉孢子粉劑及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
木霉菌隸屬于半知菌亞門，叢梗目，從梗孢科，是一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的生防益 菌。木霉菌對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度遠(yuǎn)比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空間 和營養(yǎng)源的有力競爭者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入點附近低濃度 營養(yǎng)物質(zhì)迅速占領(lǐng)空間吸收營養(yǎng)使植物病原真菌無法入侵。近年來人為向土壤中引入木霉 菌防治植物病害的研究較為活躍，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和綠色木霉防治洋蔥白腐病、 棉花和黃瓜黃萎病、人參根腐病、茉莉白絹病、西洋參立枯病及多種作物的猝倒病和疫病， 均取得較為理想的防治效果。不同種類木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 將木霉菌用于防治香蕉枯萎病的技術(shù)記載。木霉菌經(jīng)固體發(fā)酵后可產(chǎn)生大量的孢子，人們通常將大量的木霉菌孢子制成木霉 孢子粉劑以便于對其進(jìn)行貯藏、運輸和施用。目前常用的木霉孢子粉劑制備方法是用水將 木霉孢子從固體培養(yǎng)基上洗脫下來制成孢子懸浮液，在孢子懸浮液中加入適量吸水劑后將 其在室內(nèi)晾干或用低于50°C的溫度風(fēng)干制成木霉孢子粉劑。但這種制備方法加工時間長、 效率低、體積大且晾干或風(fēng)干后的木霉孢子粉劑中木霉孢子的密度較低，不便于貯藏、運輸 和施用。噴霧干燥技術(shù)是指采用霧化法將原料液分散為霧滴并用熱氣體干燥霧滴而獲得干 粉產(chǎn)品的一種干燥方法。由于成本低、易于推廣、采用的設(shè)備簡單且有利于干粉產(chǎn)品的大 規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，噴霧干燥技術(shù)在食品、化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域的運用頗為廣泛。鑒于噴霧干 燥技術(shù)的諸多優(yōu)點，人們曾試圖將噴霧干燥技術(shù)應(yīng)用到微生物活性農(nóng)藥制備領(lǐng)域，借以解 決微生物粉劑難以在保持高活性的前提下快速制備的難題。但噴霧干燥技術(shù)的溫度參數(shù)通 常在140°C以上，在此高溫條件下微生物容易失去活性。如木霉孢子在超過45°C的溫度條 件下容易失活，孢子懸浮液中的木霉孢子通過高溫高壓噴嘴噴出后基本喪失萌發(fā)能力。因 為人們尚未找到如何在干燥噴霧技術(shù)的高溫條件下保持微生物活性的解決方案，到目前為 止噴霧干燥技術(shù)在微生物活性農(nóng)藥制備領(lǐng)域尚未被合理應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于根據(jù)現(xiàn)有木霉孢子及其制備方法中存在的不足，將噴霧干燥技術(shù) 合理用于微生物活性農(nóng)藥制備，提供一種粉劑密度大，萌發(fā)率高，干燥效率高的木霉孢子粉 劑。本專利技術(shù)另一目的在于提供上述木霉孢子粉劑的制備方法。本專利技術(shù)還有一個目的在于提供上述木霉孢子粉劑的應(yīng)用。本專利技術(shù)上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種木霉孢子粉劑，包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株3T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCCNO :3531，保藏日期為2009年12月17日)的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本專利技術(shù)木霉孢子粉是具有萌發(fā)活性的孢子粉，其rDNA ITS區(qū)片段序列可以通過 PCR擴(kuò)增得到，擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反應(yīng)體系為ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上游引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 游引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反應(yīng)條件為(1) 94°C，5min， 熱變性；(2)94°C，4k，熱變性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循環(huán)。擴(kuò)增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木霉孢子粉劑中，所述助干劑為β-環(huán)糊精、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉中的一 種或幾種的混合物。本專利技術(shù)木霉孢子粉劑的制備方法包括如下步驟(1)將棘孢木霉菌株T1植于PDA培養(yǎng)基上使其復(fù)蘇，再采用酵母膏蔗糖培養(yǎng)基進(jìn) 行菌種繼代培養(yǎng)，待長出直徑為5 7mm的深綠色菌落后，將菌落接種，在酵母膏蔗糖培養(yǎng) 基和麩皮木屑培養(yǎng)物中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至長出白色菌絲或綠色孢子；(2)將白色菌絲或綠色孢子制成孢子懸浮液，過濾沉淀為濃縮孢子液；(3)向濃縮孢子液中添加助干劑，每升孢子液中加入助干劑的質(zhì)量為50g，一邊攪 拌一邊噴霧干燥，即得木霉孢子粉劑。上述制備方法中，所述酵母膏蔗糖培養(yǎng)基的最佳配方為酵母膏15g，蔗糖20g， KH2PO4Ig,麥芽膏15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維生素BO. 5mg,維生素CO. 5mg,七水合硫酸 鎂0. 05g，硫酸鐵0. Olg,瓊脂20g,水IL0上述酵母膏蔗糖培養(yǎng)基優(yōu)選高溫滅菌過的培養(yǎng)基，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為 30mino所述菌種繼代培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為48 72h。所述擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為30°C，濕度為70 85%，培養(yǎng)時間為5 7d。所述麩皮木屑培養(yǎng)物是麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水的混合物，其中，麩皮、木 屑、蔗糖三者的質(zhì)量與水的體積比為2 1 0.02，維生素B用量為每千克麩皮木屑培養(yǎng)物 中加入0. 5mg。步驟C3)所述噴霧干燥是將濃縮孢子液添加助干劑后在磁力攪拌器上一邊攪拌 一邊進(jìn)行噴霧干燥，在90 130°C范圍內(nèi)設(shè)定進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度在41 55°C，控制進(jìn)料 量為1 20wt %。作為一種優(yōu)選方案，噴霧干燥過程中進(jìn)風(fēng)溫度為110°C，出風(fēng)溫度為53°C， 進(jìn)料量為IOwt %。由于木霉菌對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)且生長速度遠(yuǎn)比病原真菌快，能對病原真菌產(chǎn)生營 養(yǎng)或空間的競爭，能有效利用植物表面的病原真菌侵入點附近的低濃度營養(yǎng)物質(zhì)迅速生長 占領(lǐng)空間消耗掉營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制了病原真菌的生長和對寄主植物的入侵，達(dá)到對植物 病害的防治效果。本專利技術(shù)木霉孢子粉劑作為微生物活性農(nóng)藥，不僅能有效防治香蕉枯萎病， 還因為棘孢木霉菌株T1具有廣譜性拮抗能力，能拮抗多種病原真菌，防治其他多種植物病 害。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果(1)本專利技術(shù)采用棘孢木霉菌株T1作為生產(chǎn)菌株，其孢子粉生存能力強(qiáng)，適應(yīng)性廣， 具有廣譜性拮抗能力，除了能對香蕉枯萎病起到有效防治，還能夠拮抗多種病原真菌，尤其 對土傳真菌有顯著的拮抗效果；(2)本專利技術(shù)將噴霧干燥技術(shù)合理用于微生物活性農(nóng)藥木霉孢子粉劑的制備中，解 決了干燥噴霧技術(shù)的高溫條件下難以保持微生物活性的技術(shù)難題，使得微生物粉劑可以在 保持高活性的前提下快速制備，制備工藝簡單易行，采用的設(shè)備簡單，有助于降低干粉產(chǎn) 品的制備成本，易于推廣，有利于干粉產(chǎn)品的大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，節(jié)省了孢子粉劑的制備時 間；(3)本專利技術(shù)木霉孢子粉劑木霉孢子密度大，萌發(fā)率高，干燥效率高，貯藏空間小，方 便人們對其進(jìn)行貯藏、運輸和使用。具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步解釋本專利技術(shù)，但實施例并不對本專利技術(shù)做任何形式的限定。實施例11.菌株的復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)(1)將冷藏的棘孢木霉菌株Tl (Trichoderma asperellum T1)植于PDA培養(yǎng)基上 使其復(fù)蘇； (2)采用酵母膏蔗糖培養(yǎng)基，并設(shè)定培養(yǎng)溫度為30°C、濕度為70 85%，對經(jīng)過步 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種木霉孢子粉劑，其特征在于包含木霉孢子粉和助干劑，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株Ｔ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ Ｔ↓［１］，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為ＣＧＭＣＣ ＮＯ：３５３１）的孢子粉，其ｒＤＮＡ ＩＴＳ區(qū)片段序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：方羽生，鐘平生，張頌聲，趙瑾，詹玉海，周俐，蔣剛彪，李小妮，高永峰，
申請(專利權(quán))人：惠州市南天生物科技有限公司，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省植物保護(hù)總站，
類型：發(fā)明
國別省市：44[]
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