純化小模塊免疫藥物蛋白的方法技術

本發明專利技術提供了基于羥基磷灰石層析的從含有高分子量(HMW)團聚體和其他雜質的蛋白制備物純化或回收蛋白，特別是小模塊免疫藥物(SMIPsTM)蛋白的方法。在一些實施方案中，所述羥基磷灰石層析與親和層析和/或離子交換層析組合使用。在一些實施方案中，根據本發明專利技術的創造性的方法包含不超過3個層析步驟。本發明專利技術還提供了根據本發明專利技術純化的諸如SMIPsTM的蛋白和含有相同蛋白的藥物組合物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請參考本申請要求2009年3月11日提交的美國臨時專利申請第61/159，347號的權益， 其內容整體援引并入本文。
技術介紹
通常，當生產藥用蛋白時，在其可以用于診斷應用、治療應用、應用細胞生物學和功能研究之前，必須從蛋白制備物去除污染物。例如，從培養細胞收獲的蛋白制備物常含有不需要的組分，如細胞產生的蛋白的高分子量(HMW)團聚體。在給藥時高分子量團聚體可以通過引起補體激活或過敏反應而不利地影響產品安全性。此外，團聚體可以通過引起產物產量減少、峰加寬和活性丟失來阻礙制造過程。與抗體和其他治療性蛋白相比，小模塊免疫藥物(SMIP )蛋白屬于相對較新種類的藥物蛋白。因此，由于對這類型蛋白缺乏認識，SMIP 蛋白的純化特別具有挑戰性。此外， SMIP 蛋白具有高聚集傾向。例如，細胞培養物中HMW團聚體的百分率可以高達50-60%。專利技術概述本專利技術提供了純化含有HMW團聚體的蛋白的有效方法。本專利技術涵蓋了以下發現， 利用不超過3個層析步驟可以從含有高百分率HMW團聚體(例如，超過50-60%)的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白。因此，根據本專利技術的創造性的方法減少了柱步驟的數量， 導致加工時間顯著減少并且產物產量顯著提高。本專利技術特別有益于純化小模塊免疫藥物蛋白。本專利技術的方法還可以用于純化其他蛋白，特別是那些具有聚集傾向的蛋白。在一方面，本專利技術提供了從含有高分子量團聚體的蛋白制備物，其包括在操作條件下使所述蛋白制備物進行羥基磷灰石層析的步驟，使得所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4%的團聚體(例如，少于3. 5%,3%,2. 5%, 2%、1.5%、1%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%、0.2%或0. 1% )。在一些實施方案中，根據本專利技術的方法包含不超過3個層析步驟。在一些實施方案中，所述操作條件包括在磷酸鹽緩沖液中從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。在一些實施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無內毒素的。在一些實施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無熱原的。在一些實施方案中，所述磷酸鹽緩沖液包含磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。在一些實施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液含有在lmM-50mM濃度范圍的磷酸鈉。在一些實施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液還含有在100mM-2. 5M濃度范圍的氯化鈉。在一些實施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液含有在2mM-32mM濃度范圍的磷酸鈉和在IOOmM-L 6M濃度范圍的氯化鈉。在一些實施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液具有6. 5-8. 5 范圍的PH。在一些實施方案中，所述操作條件包括通過NaCl梯度從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實施方案中，所述操作條件包括通過NaCl分步洗脫方法從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實施方案中，所述操作條件包括通過磷酸鹽梯度(例如，線性磷酸鹽梯度)從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實施方案中，所述羥基磷灰石層析使用含有I型或II型陶瓷羥基磷灰石樹脂的柱。在一些實施方案中，所述柱含有I型陶瓷羥基磷灰石樹脂。在一些實施方案中，適合羥基磷灰石層析的樹脂直徑為ι μ rn-l, 000 μ m。在一些實施方案中，適合羥基磷灰石層析的樹脂直徑為10 μ m-100 μ m。在一些實施方案中，所述方法還包括在羥基磷灰石層析步驟之前通過親和層析純化蛋白制備物的步驟。在一些實施方案中，所述親和層析步驟使用結合至免疫球蛋白恒定結構域的蛋白吸收劑。在一些實施方案中，所述親和層析使用結合至免疫球蛋白可變結構域的蛋白吸收劑。在一些實施方案中，適合本專利技術的蛋白吸收劑結合至VH3結構域或與VH3 同源的結構域(例如，來自VH3家族的結構域)。在一些實施方案中，適合本專利技術的蛋白吸收劑包含A蛋白。在一些實施方案中，所述親和層析使用MabklectTMrfr0tein A樹脂柱。 在一些實施方案中，根據本專利技術的方法還包括加入添加劑(例如，PEG和/或其他非離子型有機聚合物)以促進結合至蛋白吸著劑的步驟。在一些實施方案中，所述親和層析步驟包含利用洗滌緩沖液洗滌親和層析柱，所述洗滌緩沖液包含Hepes、氯化鈉、氯化鈣、精氨酸、Tris、氯化鎂、組氨酸、尿素、咪唑、一種或多種有機溶劑(例如，乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、異丙醇和丁醇)和/或去污劑 (例如，離子型或非離子型)。在一些實施方案中，所述親和層析步驟包含利用洗脫緩沖液從親和層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白，所述洗脫緩沖液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化鎂、尿素、丙二醇、乙二醇、一種或多種有機酸(例如，乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、苯二甲酸和水楊酸)和/或精氨酸。在一些實施方案中，所述洗脫緩沖液還包含選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其組合的鹽。在一些實施方案中， 所述鹽濃度范圍為ImM-lM。在某些實施方案中，所述鹽濃度范圍為lmM-500mM。在某些實施方案中，所述鹽濃度范圍為ImM-IOOmM在一些實施方案中，根據本專利技術的方法還包含利用陰離子交換層析樹脂通過陰離子交換層析純化蛋白制備物的步驟。在某些實施方案中，根據本專利技術的方法還包含在親和層析之后但是在羥基磷灰石層析步驟之前通過陰離子交換層析純化蛋白制備物的步驟。在一些實施方案中，根據本專利技術的方法還包含加入添加劑以增強小模塊免疫藥物蛋白和/或雜質結合至陰離子交換層析樹脂的步驟。在一些實施方案中，加入的添加劑誘導一種或多種污染物或雜質從蛋白制備物沉淀。在一些實施方案中，通過過濾從蛋白制備物去除沉淀的污染物。在一些實施方案中，合適的添加劑為或含有非離子型有機聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纖維素、葡聚糖、淀粉和/或聚乙烯吡咯烷酮)。在一些實施方案中，所述方法還包含在親和或陰離子交換層析之前將蛋白制備物應用于深層濾器(cbpth filter)的步驟。在一些實施方案中，所述方法還包含一個或多個過濾步驟。在一些實施方案中，所述一個或多個過濾步驟包含病毒保留過濾步驟。在一些實施方案中，所述一個或多個過濾步驟包含超濾和/或滲濾步驟。在一些實施方案中，所述蛋白制備物是從培養的細菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、無細胞培養基、轉基因動物或植物制備的。在一些實施方案中，所述蛋白制備物為細胞培養基制備物。在一些實施方案中，所述培養基制備物含有從培養細胞分泌的小模塊免疫藥物蛋白。在某些實施方案中，所述培養細胞為CHO細胞。在某些實施方案中，所述培養基制備物是從大型生物反應器制備的。在一些實施方案中，待純化的蛋白制備物含有細胞提取物。在一些實施方案中，待純化的蛋白制備物是從包涵體制備的。在另一方面，本專利技術提供了從含有高分子量團聚體的蛋白制備物，所述方法通過使所述蛋白制備物在操作條件下進行(a)親和層析和/或離子交換層析(例如，一個或兩個離子交換層析步驟)，和(b)羥基磷灰石層析，使得純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4% (例如，少于3. 5%,3%,2. 5%,2%U. 5%U%>0. 8%, 0.6%,0.5%,0.4%,0.2%,0. 1% )的團聚體。在一些實施方案中，使所述蛋白制備物進行(al)親和層析、(^)離子交換層析和(b)羥基磷灰石層析。在一些實施方案中，使所述本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C·加洛，S·孫，J·E·布思，J·科米爾，D·拉卡斯，A·諾伊斯，
申請(專利權)人：惠氏有限責任公司，
類型：發明
國別省市：