本發(fā)明專利技術提供使用用于改變花色的有用的轉錄調控區(qū)域并通過基因重組技術在菊花植物或除菊花以外的植物中控制類黃酮合成系統(tǒng)的方法、修飾花色素苷的方法、生產(chǎn)在花瓣中含有經(jīng)過修飾的花色素苷的菊花植物或除菊花以外的植物的方法、及導入了該調控區(qū)域的菊花植物或除菊花以外的植物、或其后代或其營養(yǎng)繁殖體或其部分或組織。本發(fā)明專利技術所涉及的方法中，使用紫蘇花色素苷3-酰基轉移酶基因的轉錄調控區(qū)域，例如含有序列號1所示的堿基序列的核酸，或使用三色堇F3’5’H基因的轉錄調控區(qū)域，例如包含含有序列號15所示堿基序列的核酸的表達載體或表達盒。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用來自紫蘇的花色素苷3-酰基轉移酶(3AT)基因而在菊花植物中控制類黃酮生物合成系統(tǒng)的方法、修飾花色素苷的方法、及導入該基因的菊花植物或其后代或其營養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。本專利技術還涉及來自三色堇的類黃酮3'，5'-羥化酶(以下也稱為F3' 5' H)基因#40(以下也稱為BP40。)的轉錄調控區(qū)域及其使用。
技術介紹
通過利用基因重組技術，使有用的基因在目的植物中表達，可將新的性狀賦予該植物。如此制作的基因重組植物已被大范圍栽培。基因表達的調控主要在轉錄階段進行控制，所以轉錄調控在調控基因表達上最為重要。即為制作產(chǎn)業(yè)上有用的基因重組植物，在適當時期、用適當組織、以適當強度轉錄非常重要。轉錄在很多情況下通過位于轉錄區(qū)域的5’ 側的DNA序列來控制。將確定基因轉錄的起始位點、直接調控其頻率的DNA上的區(qū)域稱為啟動子。啟動子有時存在于起始密碼子的5’側數(shù)十bp處，多含有TATA盒等的序列。其還在 5’側具有結合各種轉錄調控因子的順式作用元件，這些順式作用元件的存在控制著轉錄的時期、進行轉錄的組織、轉錄的強度。轉錄調控因子根據(jù)氨基酸序列的不同分為很多家族。 例如，Myb型轉錄調控因子、bHLH(堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix loop helix))型轉錄調控因子等是有名的家族。實際上，很多情況下，轉錄控制區(qū)域與啟動子在同樣意義上使用。作為花的顏色的主要成分的花色素苷為總稱為類黃酮的次級代謝產(chǎn)物之一。花色素苷的顏色依賴于其結構。即作為花色素苷的發(fā)色團的花色素B環(huán)的羥基數(shù)增加時顏色變藍。且還已知修飾花色素苷的芳香族酰基(香豆酰基、咖啡酰基等)的數(shù)量增加時，花色素苷的顏色變藍(即最大吸收波長向長波長移動)，花色素苷的穩(wěn)定性增加(以下參照非專利文獻1)。與花色素苷的生物合成有關的酶及編碼該酶的基因被廣泛研究(參照相同非專利文獻1)。例如，催化向花色素苷轉移芳香族酰基的反應的酶基因可從龍膽、薰衣草、矮牽牛等中獲得(以下參照專利文獻1、專利文獻2)。與紅紫蘇葉中積累的花色素苷(丙二酰基紫蘇寧、3-0- (6-0- (E) -ρ-香豆酰基-β -D-吡喃葡萄糖基)-5-0- (6-0-丙二酰基-β -D-glucopyranosyl)-花青素(3-0- (6-0- (E) -p-coumaroyl- β -D-glucopyranosyl) -5-0- (6-0-malonyl- β -D-glucopyranosyl) -cyanidin))(以下參照非專利文獻 2)的合成有關的酶基因以羥基肉桂酰輔酶A 花色素苷3葡萄糖苷-芳香族酰基轉移酶(3AT)的基因 {以下簡稱“紫蘇花色素苷3-酰基轉移酶(3AT)基因”。}為代表已有報道(參照相同專利文獻1)。而且也獲得了關于花色素苷的生物合成酶基因轉錄控制(調控)的知識和見解。 這些基因的位于起始密碼子5’側的轉錄調控區(qū)域中，具有Myb型轉錄調控因子、bHLH型轉錄調控因子結合的順式作用元件序列。還已知Myb型轉錄調控因子和bHLH型轉錄調控因子控制矮牽牛、玉米、紫蘇等的花色素苷的合成(參照相同非專利文獻1)。在植物中負責基因轉錄的啟動子(以下稱轉錄調控區(qū)域)中，有無論在何種組織或發(fā)育階段的何種時期均發(fā)揮功能的所謂組成型啟動子、和僅在特定器官·組織中發(fā)揮功能的器官·組織特異性啟動子、及僅在發(fā)育階段的特定時期表達的時期特異性啟動子。作為用于使有用基因在基因重組植物中表達的啟動子，常用的是組成型啟動子。作為代表性的組成型啟動子，有花椰菜花葉病毒35S (以下也稱為CaMV35Q啟動子、以此為基礎構建的啟動子(以下參照非專利文獻3)、Macl啟動子(以下參照非專利文獻4)等。但是，在植物中，很多基因均為組織·器官特異性或時期特異性表達。這說明使基因進行組織·器官特異性或時期特異性表達對植物來說是必需的。有利用此種組織 器官特異性或時期特異性的轉錄調控區(qū)域進行植物的基因重組的例子。例如，有使用種子特異性的轉錄調控區(qū)域使蛋白質在種中積累的例子。但是，植物雖可開出多種顏色的花，但由于種所具有的遺傳性限制，所以能開出所有顏色的花的種很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能開藍色、紫色花的品種。原因是月季、康乃馨不具有用于合成許多開藍色、紫色花的種所合成的稱為花翠素的花色素時所必需的F3’ 5’ H基因。通過在這些種中導入作為開藍色、紫色花的種的矮牽牛、三色堇等的F3’ 5’ H基因，可使這些種的花色變藍。為康乃馨的情況下，為使來自不同種的 F3’ 5’ H基因轉錄，使用來自金魚草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉錄調控區(qū)域。例如， 作為包含來自金魚草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉錄調控區(qū)域的質粒，可例舉以下專利文獻3中記載的質粒pCGP485、pCGP653，作為包含組成型轉錄調控區(qū)域的質粒，可例舉質粒pCGP6^ (包含Macl啟動子)、以下專利文獻4中記載的質粒pSPB130 (包含附加有增強子的CaMV35S啟動子)。但是，很難預測這樣的啟動子在重組植物中可在何種程度上發(fā)揮作用，是否可帶來目的表達型。且為使復數(shù)的外源基因表達而反復使用相同啟動子有時會引起基因的沉默，所以應考慮避免(以下參照非專利文獻5)。因此，雖然一些啟動子被用于改變花的顏色，但還進一步需要與目的宿主植物的目的相符合的有用的啟動子。特別是菊花植物(也簡稱“菊花”。)約占日本全國批發(fā)價格(農(nóng)林水產(chǎn)省統(tǒng)計的平成19年花卉批發(fā)市場調查結果概要)中的30%，與月季約占9%、康乃馨約占7%相比， 可見其重要性。菊花中雖有白色 黃色 橙色 紅色 粉色 紫紅色等的花色，但還沒有紫色、藍色等藍色系的花色。因此，藍色系的育種成為用于喚起新需求的目標之一。菊花的花色通過花色素苷和類胡蘿卜素的組合來體現(xiàn)。花色素苷由于作為基本骨架的花色素的結構不同、通過糖、有機酸而進行的修飾的不同等，可出現(xiàn)多種顏色。但是，已知負責菊花花色的花色素苷僅有花青素的3位被葡萄糖和丙二酸修飾的兩種即cyanidin 3-0-(6" -0-monom alonyl-β -glucopyranoside 禾口 cyanidin 3-0-(3 “ ,6 “ -Ο-dimalonyl-β -glucop yran0Side(以下參照非專利文獻6)。且其結構比較單純(參照圖1)。由于上述原因，菊花的花色素苷成為使顯色范圍極小的主要原因。如上所述，菊花在日本是最重要的花卉，但因具有六倍體這樣的多倍性，且基因組尺寸大，所以不僅轉化效率低，還會引起導入基因的沉默(鈍化)，因而不易得到穩(wěn)定表達導入基因的基因重組菊花。有如下報道，導入連接在CaMV35S啟動子上的β-葡萄糖醛酸酶 (⑶S)基因的菊花與導入相同基因的煙草相比，⑶S基因的活性為10分之1左右，且在轉化5后經(jīng)過12個月以后，在幾乎所有的個體中其活性均降低(以下參照非專利文獻7)。有報道指出，已經(jīng)得到了用于使外源基因在菊花中穩(wěn)定表達的編碼在菊花中發(fā)揮良好功能的葉綠素a/b結合蛋白質的基因的啟動子，但該啟動子不適合使基因在基本不存在葉綠素的花瓣中表達(以下參照非專利文獻8)。還有如下報道，將連接在煙草的延伸因子(elongation factor) 1 (EF本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：野田尚信，間竜太郎，佐藤早苗，大宮明美，田中良和，
申請(專利權)人：三得利控股株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：
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