生物材料及其用途制造技術

提供了調節慢性炎癥反應的試劑，其中所述試劑調節生腱蛋白-C的生物活性。還提供了鑒定調節生腱蛋白-C和慢性炎癥的試劑的方法。還提供了所述試劑的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】生物材料及其用途本專利技術涉及生腱蛋白-C和其在慢性炎癥中的活性。還提供了生腱蛋白-C和其生物活性的調節劑以及進一步地生腱蛋白-C在上調或下調慢性炎癥的試劑的鑒定中的用途。炎癥是組織對有害刺激例如病原體、組織損傷或刺激物的復雜生物反應。其是組織為了去除致害(injurious)刺激以及啟動組織的愈合過程進行的保護性攻擊。與炎癥有關的異常包括一大組不相關的 異常，該異常是多種人類疾病(炎性疾病)的基礎。具有炎癥表現的疾病的實例包括(但不限于)哮喘、自身免疫性疾病、腎小球腎炎、過敏癥(超敏反應)、炎性腸病、再灌注損傷、類風濕性關節炎和移植排斥。特別地，慢性炎癥是與上述疾病的多種相關的虛弱和嚴重的病情，并且其特征是，在感染或損傷部位的持久炎癥，或者涉及免疫應答的改變，例如在自身免疫性疾病中。類風濕性關節炎(RA)雖然不是唯一的，但卻是慢性炎癥性病情的典型實例。RA的特征在于，由促炎細胞因子和基質金屬蛋白酶(MMP)的持久合成所介導的滑膜炎以及關節軟骨和骨的破壞。抑制炎癥細胞因子例如TNFa和IL-6的合成的生物化合物在長期治療RA方面是成功的。然而，需要重復治療使得該生物化合物成為昂貴的治療方法，并且不能提供長期緩解。此外，對細胞因子功能進行完全的全身性抑制并非沒有內在的問題，例如感染風險的增加。因此，盡管在護理中有進步，但是其仍未滿足在長時間內有效的經濟的慢性炎癥的治療的需要(Smolen (2006)和 Williams (2007))。支撐疾病的慢性的機制仍然不清楚并且促使炎癥介質和破壞介質延長表達的因素(或多種因素)目前尚未知曉。Toll樣受體(TLR)在推動RA中炎癥介質的生成中起關鍵作用，而TLR功能的阻滯在臨床上可以是有顯著的益處的(在Brentano (2005)和O’Neill (2002)中綜述)。該受體家族形成免疫系統的完整部分。TLR通過識別病原相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)來介導宿主防御感染和損傷(Matzinger (2002))。DAMP是根據組織損傷而產生的內源性促炎分子并且包括由損傷細胞或壞死細胞釋放的細胞內分子、細胞外基質(ECM)分子的片段或對損傷上調的ECM分子(在Bianchi (2007)和Gordon (2002)中綜述)。在活化后，TLR促進先天免疫應答和后天免疫應答，包括促炎細胞因子和MMPs的表達的刺激(Medzhitov (2002))。TLR在來自RA患者的滑膜組織中高水平表達(Radstake (2004)、Roelofs (2005)、Sacre (2007)和(Sacre, 2008 年提交的原稿)，并且其保護在TLR4中具有靶向的刪除以及功能的喪失的突變的小鼠免受實驗性關節炎(Choe (2003)和Lee (2005)。此外，TLR4的抑制劑可以減輕小鼠的破壞性關節炎(Abdollahi-Roodsaz (2007))，而在I期預試驗中假定的TLR4抑制劑使23例患有中度至重度RA的患者中的15例的癥狀得到改善(Vanags (2006)。然而，在疾病發病機制中涉及哪種TLR配體(或多種配體)不清楚。生腱蛋白-C是與組織損傷和傷口修復有關的ECM糖蛋白。生腱蛋白-C在胚胎發生過程中的活性組織再造時特異性表達，所述的表達在原腸胚形成和體節形成過程中最先觀察到。在發育的隨后階段，表達限于乳腺和肺的分支形態發生的部位、正在發育的骨骼中、心血管系統中和上皮到間質轉化部位的連接組織。一旦這些過程停止并且在胚胎發生結束之前，該表達下調(Jones (2000)。生腱蛋白-C在健康成人組織中不是通常地表達的，但在成人中，在極性炎癥過程中特異性地并且短暫地被上調，而在慢性炎癥中被持久地表達(Chiquet-Ehrismann(2003)中綜述)。免疫組織化學研究顯示，生腱蛋白-C在正常的人類關節中有少量表達，但在RA滑膜中；在炎癥和纖維化的區域中，特別地在滑膜襯里以下的區域中；在侵襲血管翳和血管周圍，生腱蛋白-C的表達水平極大地增加(Cutolo (1992)、MacCachren (1992)和Salter (1993))。在 RA 患者的滑膜流體中(Chevalier (1994)和 Hasegawa(2007))以及在RA軟骨(Salter (1993)和Chevalier (1994))中，生腱蛋白-C的水平也顯著性增加。生腱蛋白-C是150萬Da的大的六聚體蛋白。 每條鏈包含不同的結構域，所述的鏈包括裝配結構域(assembly domain) (TA)、EGF 樣結構域(EGF-like repeats) (EGF-L) >III型纖維蛋白樣重復(fibronectin type III-Iike repeats) (TNIII)和纖維蛋白原樣結構域(fibrinogen-like globe, FBG) (Orend(2005)中綜述)。生腱蛋白-C的序列和其結構域顯示于附圖說明圖13中。在之前，炎癥中生腱蛋白-C的作用尚不確定，并且有證據表明對不同免疫細胞的作用不同。例如，生腱蛋白-C已經顯示，支持原代人類外周血液和扁桃體淋巴細胞粘合和壓延加工，從而暗示了在刺激淋巴細胞轉移中的作用(Clark(1997))。此外，對于小鼠中伴刀豆球蛋白A誘導的肝損傷，生腱蛋白-C基因敲除小鼠(tenascin-C-null mice)展示了降低的淋巴細胞浸潤和較低水平的IFN、TNF和IL-4mRNA (El-Karef (2007))。因此，證據表明，生腱蛋白-C涉及提高急性炎癥細胞的活性。然而，還報道了生腱蛋白-C在體外抑制單核細胞趨藥性(Loike(2001))，并且生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示了哺乳動物腫瘤間質組織中單核細胞和巨噬細胞遷移的增加(Talts(1999))。該證據因此顯示生腱蛋白-C具有抑制炎癥細胞的作用。專利技術人已表明，生腱蛋白-C是內源性TLR4配體，所述內源性TLR4配體對于關節炎中觀察到的破壞性關節炎癥是必需的。此外，現在表明生腱蛋白-C不涉及炎癥(急性炎癥反應)的誘導，但涉及表征慢性炎癥病情的炎癥反應的延長。特別地，現已表明生腱蛋白-C是TLR4的內源性活化劑，并且證實了該分子對于破壞性關節炎是必需的。基于在小鼠體內，將生腱蛋白-C的FBG結構域注射到關節內，通過誘導關節炎證實了在關節中生腱蛋白-C在介導免疫應答中的作用。此外，由酵母多糖誘導的急性關節炎在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中未被延長。野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠對酵母多糖誘導的急性關節炎反應相同，證實了生腱蛋白-C似乎不涉及炎癥的啟動。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示不太持久的滑膜炎顯示了在關節炎的維持中的作用。生腱蛋白-C的靶向刪除在用mBSA免疫而誘導的關節炎過程中保護小鼠免受持續侵蝕關節炎之害，這一觀察結果強調了生腱蛋白-C在延長關節炎中的重要性。現已表明生腱蛋白-C能夠激活關節中的細胞，并且已將生腱蛋白-C的主要活性域對應于纖維蛋白原樣結構域(FBG)，其為在分子的C端227個氨基酸(26. 9kDa)的球狀結構域(Siri (1991)) ο在來自RA患者的滑膜培養物中，FBG的加入增強了促炎細胞因子的自發釋放。本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.03.13 GB 0904355.51.一種調節慢性炎癥反應的試劑，其中，所述試劑調節生腱蛋白-C的生物活性。2.如權利要求I所述的試劑，其中，所述試劑通過改變生腱蛋白-C的轉錄、翻譯和/或結合特性調節生腱蛋白-C的生物活性。3.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中，所述試劑下調生腱蛋白-C的生物活性。4.如權利要求1-2中任一項所述的試劑，其中，所述試劑上調生腱蛋白-C的生物活性。5.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C轉錄的抑制劑。6.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C翻譯的抑制劑。7.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C結合特性的抑制劑。8.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C的競爭性結合抑制劑。9.如權利要求1-3或I中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是TLR-4受體的拮抗劑。10.根據前述任一項權利要求所述的試劑，其中，所述試劑選自短的干擾RNA(SiRNA)分子、短的發夾RNA分子(shRNA)、反義寡核苷酸、對生腱蛋白-C具有結合親和力的化合物、抗體(多克隆的或單克隆的)和其抗原結合片段、小的抑制劑化合物、生腱蛋白-C或其變體的結構域、多肽和蛋白質。11.根據權利要求10所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段選自Fv片段、scFv片段、Fab、單可變域和域抗體。12.如權利要求10-11中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段是人源化的。13.如權利要求10-12中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段對Toll樣受體4(TLR4)、生腱蛋白-C或其結構域具有特異性。14.如權利要求10-12中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段對生腱蛋白-C的FBG結構域具有特異性。15.一種鑒定調節生腱蛋白-C活性的試劑的方法，所述方法包括 (i)提供一種或多種候選試劑； (ii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C和所述的一種或多種候選試劑接觸； (iii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C接觸并且不與候選試劑接觸； (iv)與對照步驟(iii)的細胞相比，確定步驟(ii)中所述候選試劑是否調節生腱蛋白-C對所述一個或多個細胞的效應。16.如權利要求15所述的方法，其中，所述生腱蛋白-C的活性被上調。17.如權利要求15所述的方法，其中，所述生腱蛋白-C的活性被下調。18.如權利要求15-17中任一項所述的方法，其中，步驟(ii)和步驟(iii)的細胞表達Toll 樣受體 4(TLR4)。19.如權利要求15-18中任一項所述的方法，其中，所述一個或多個細胞選自炎癥細胞、成纖維細胞、成纖維細胞樣細胞(包括RA滑膜成纖維細胞，也稱為滑膜細胞)、小鼠胚胎成纖維細胞、人胚腎細胞。20.如權利要求19所述的方法，其中，所述炎癥細胞選自巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞、淋巴細胞、單核細胞樣細胞和巨噬細胞樣細胞。21.一種通過進行權利要求15-20所述的方法來鑒定調節慢性炎癥反應的試劑的方法。22.如權利要求21所述的方法，其中，所述慢性炎癥反應與特征為不適當炎癥的疾病有關。23.如權利要求21或22所述的方法，其中，所述慢性炎癥反應與類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病有關。24.如權利要求23所述的方法，其中，所述慢性炎癥與類風濕性關節炎(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·S·梅伍德，B·M·J·佛克斯維勒，
申請(專利權)人：帝國創新有限公司，
類型：發明
國別省市：