檢測由微生物所引起感染的凝集反應的改良方法技術

檢測由微生物所引起感染的凝集反應的改良方法包括：用蛋白質染色劑對試驗血清、血漿或血液或者經純化的抗體進行染色；將具有染色的抗體的血清、血漿或血液與等量的著色的在玻璃玻片上的抗原顆粒進行混合；向所述混合物中添加與生物素綴合的經稀釋的抗球蛋白；對混合物進行混合步驟；向混合物中添加經稀釋的親和素（優選地用可見指示劑進行標記），并將所有成分充分混合。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及。本專利技術還涉及高靈敏的凝集試驗，稱為“超凝集試驗”，用于診斷由多種微生物引起的感染，并且避免在使用常規凝集試驗通常產生的假陽性和假陰性結果。
技術介紹
凝集試驗能夠用作測定抗原或抗體存在的定性試驗，或者用作測量針對特定抗原的抗體水平的定量試驗。快速平板試驗(Rapid PlateTest, RPT)或平板凝集試驗(Plate Agglutination Test, PAT) / 玻片凝集試驗(Slide Agglutination Test, SAT)是用于檢測針對血清中微生物的抗體的篩選試驗。陽性血清樣品進行試管凝集實驗(TubeAgglutination Test,TAT)用于進一步驗證和對抗體滴度的定量。在定量試驗中，制 備待針對抗體進行試驗的血清樣品的系列稀釋物，并隨后添加固定量的顆粒抗原。產生可見凝集反應的最大稀釋度被稱作滴度。凝集反應的強度是血清中抗體濃度的最好指示。非常低濃度的抗體不產生可見的凝集反應。在高濃度的抗原或抗體缺少凝集反應被稱作前帶效應(Prozone effect)。在前帶中形成非常少的復合物,其不聚集而形成可見的凝集反應。這些因素也導致假陰性結果。在許多國家，標準的平板凝集試驗是用于人布魯桿菌病的常規試驗。然而，其會產生假陰性結果(WHO報告，1986 ;Lucero和Bolpe, 1998)。玫瑰紅平板試驗(Rose BengalPlate Test, RBPT)是平板/玻片凝集試驗的變體，其中用玫瑰紅染料染色的殺死的布魯桿菌屬(Brucella)微生物用作檢測血清中抗體的抗原。國際獸疫組織(TheInternationalOffice of Epizootics)推薦將RBPT作為診斷牛布魯桿菌病診斷的一種試驗(Corbel和MacMillan，1995)。RBPT是用于診斷布魯桿菌病的快速、廉價和有效的試驗。其可以使用最低限度的設備進行，并且最終結果通過裸眼讀取。然而，有許多因素影響RBPT反應及其讀取結果。有些人能夠看出較細小的凝集反應，而許多其他人不行。這導致了結果的多變。一些作者(Saravi等人，1990)報道了使用RBPT產生假陰性的不可接受的比例。當用于對來自低患病率群/組中動物的血清進行試驗時，從不同來源獲得的RBPT抗原的靈敏度也變化很大(Blasco等人，1994)。常規凝集試驗是用于診斷感染性疾病的簡單廉價方法。然而與其他血清學試驗例如ELISA、Western印記等相比，其具有較低的靈敏度及因此更高幾率的假陰性結果。早期增強凝集反應的嘗試開發出了非直接庫姆斯氏試驗(Indirect Coombs’ Test)和共凝集試驗(Coagglutination Test)。使用抗球蛋白的非直接庫姆斯氏試驗已經用于血清抗體的交聯以產生凝集的更大團塊(clump)而易于檢測。然而，抗球蛋白單獨與抗球蛋白的疏松末端形成抗體的擴散網，這用肉眼很難檢測。共凝集是用于篩選和快速診斷感染性疾病的靈敏試驗。然而，其需要以非特異性方式結合免疫球蛋白的蛋白質A，并是昂貴的且制備方法復雜。此外，由于不能區分單獨抗原顆粒的非特異性凝集和抗原與抗體結合形成的特異性凝集，庫姆斯氏抗球蛋白試驗和共凝集試驗兩者都可能產生假陽性結果。目前可用診斷試驗的局限性包括a)可用凝集試驗和基于其的試劑盒具有較低靈敏度和更高幾率的假陰性結果。b)不能區分不恰當混合形成的顆粒抗原的非特異性凝集和抗原與抗體的特異性凝集，從而在常規凝集試驗中產生假陽性結果。c)使用抗球蛋白的非直接庫姆斯氏試驗已經用于血清抗體的交聯以產生凝集的更大團塊而易于檢測。然而，抗球蛋白單獨與抗體結合抗球蛋白的疏松末端形成抗原-抗體團塊的廣泛擴散網，而用肉眼很難檢測。d)共凝集試驗依賴蛋白質A，其是昂貴的并非特異性地結合免疫球蛋白。e)由于不能區分單獨抗原顆粒的非特異性凝集和抗原與抗體結合形成的特異性凝集，庫姆斯氏抗球蛋白試驗和共凝集試驗兩者都可能產生假陽性結果。f) ELISA和Western印記需要受訓的技術人員以及配置良好的實驗室，而這在發 展中國家比較少。基于這些測定法的試劑盒是昂貴的。g)分子診斷技術只能由訓練良好的技術人員在配置良好的實驗室中進行，這在發展中國家比較少。基于這些測定法的商用試劑盒是昂貴的。專利技術目的本專利技術的一個目的是提供檢測由多種由微生物所弓I起感染的凝集反應的改良方法。本專利技術的另一個目的是提供開發用于感染性疾病的非常靈敏、特異性、廉價并易于使用的診斷測定法和基于其的診斷試劑盒的方法。本專利技術的另一個目的是提供用于準確診斷以及用于快速篩選和監測大量感染性疾病的方法。另外，本專利技術的目的還在于提供開發可靠凝集試驗以消除常規凝集試驗通常具有的假陽性結果的可能性的方法。本專利技術的再另一個目的是提供開發可靠凝集試驗以消除常規凝集試驗通常具有的假陰性結果的可能性的方法。本專利技術還有一個目的是提供診斷方法和基于其的診斷試劑盒，其是penside方式并且其結果易于通過肉眼檢測。專利技術簡述包括用蛋白質染色劑對試驗血清、血漿或血液或者經純化的抗體進行染色；將具有染色的抗體的血清、血漿或血液與等量的著色的在玻璃玻片上的抗原顆粒進行混合；向所述混合物中添加與生物素綴合的經稀釋的抗球蛋白；對混合物進行混合步驟；向混合物中添加經稀釋的親和素(優選地用可見指示劑進行標記)，并將所有成分充分混合。附圖說明圖A.使用抗原(Ag)和陽性血清(Ab)的常規凝集。圖B.使用IgG和IgM抗球蛋白(AG)的增強凝集。圖C.使用生物素化的抗球蛋白(bAG)和親和素(Av)的超凝集。圖I.由抗原和陽性血清引起的正常凝集。圖2.使用染色的抗體、生物素化的抗球蛋白和親和素的超凝集(宏觀)。圖3.超凝集(微觀)專利技術詳述顆粒抗原與抗體的反應產生抗原的聚集，這稱為凝集反應。凝集測試通過顯示血清、血漿或血液中針對感染性微生物的抗原的抗體存在，用在感染的診斷中。凝集試驗只在使用顆粒抗原中有效。然而，可以用可溶性抗原(例如病毒抗原)包被顆粒例如乳膠珠，并將經包被的顆粒用在凝集試驗中以檢測針對所述可溶性抗原的抗體。在乳膠凝集試驗(LatexAgglutination Test)中，將用抗原包被的顯微乳膠珠的懸浮液與血清、血衆或全血樣品混 合。如果樣品中存在抗體，它們將與珠上的抗原結合，引起它們凝集或聚集。這種聚集可以可視地進行檢測。凝集試驗非常迅速，因為與使用基于其他試驗的試劑盒需要幾個小時來顯示結果相比，其可以在5分鐘內檢測抗體。凝集試驗是用于診斷感染性疾病的簡單廉價方法。然而與其他血清學試驗例如ELISA、Western印記等相比，其具有較低的靈敏度及因此更高幾率的假陰性結果。早期增強凝集反應的嘗試開發出了非直接庫姆斯氏試驗(也稱為庫姆斯氏抗球蛋白試驗，Coombs’Antiglobulin Test)和共凝集試驗(Coagglutination Test)。然而，庫姆斯氏抗球蛋白試驗由于抗球蛋白Fe區的松散末端而具有形成更大抗原-抗體團塊網的局限。共凝集是用于篩選和快速診斷感染性疾病的靈敏試驗。然而，其需要以非特異性方式結合免疫球蛋白的蛋白質A，并是昂貴的且制備方法復雜。此外，由于不能區分單獨抗原顆粒的非特異性凝集和抗原與抗體結合形成的特異本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.09.30 IN 1345/DEL/091.檢測由微生物所引起感染的凝集反應的改良方法，其包括 用蛋白質染色劑對試驗血清、血漿或血液或者經純化的抗體進行染色； 將具有染色的抗體的血清、血漿或血液與等量的著色的在玻璃玻片上的抗原顆粒進行混合； 向所述混合物中添加與生物素綴合的經稀釋的抗球蛋白； 對混合物進行混合步驟； 向混合物中添加經稀釋的親和素(優選地用可見指示劑進行標記)，并將所有成分充分混合。2.權利要求I的方法，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：H·M·薩克塞納，
申請(專利權)人：生物技術部，安格德·德夫·古魯獸醫和動物科學大學，
類型：發明
國別省市：