高效降解兩種真菌毒素的工程菌及應用制造技術

本發明專利技術公開了高效降解兩種真菌毒素的工程菌及應用。在本發明專利技術所述的工程菌中導入了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）兩種真菌毒素的高效降解酶的編碼基因，得到具有高效降解DON和ZEN兩種毒素能力的工程菌。該工程菌可直接有效地應用于真菌毒素的削減.。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于發酵及生物
，具體涉及兩種真菌毒素高效降解工程菌的構建及其應用。
技術介紹
真菌毒素是產毒真菌在危害過程中產生的一類次生代謝物質，主要包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏馬毒素(FUM)和赭曲霉毒素等，近幾年，由于我國極端氣候的頻繁出現，導致了以危害小麥、玉米為主的赤霉病的大流行，該菌危害產生的DON和ZEN污染加重，污染超標的小麥和玉米不斷增加，為保障我國的人民消費安全和畜牧養殖安全，國家糧食局及有關部門對2010年我國黃淮海地區小麥收獲季節 感染嚴重的赤霉病，導致脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)大面積超標毒素超標小麥及時進行了封存，共計174. 5萬噸。由于缺乏行之有效的安全處理技術，目前仍處于封存狀態。2012年的赤霉病導致的小麥產量減產和毒素超標減產也極為嚴峻。對于真菌毒素(DON和ZEN)的清除，目前國內外較為普遍的方法主要有物理去除及吸附、化學處理等。對已經污染真菌毒素谷物的物理、化學處理方法主要有沖洗和漂洗、熱處理、離子福射、無機吸附、化學試劑的處理及臭氧氧化等，Bullerman等認為通過清洗，可以將被污染的小麥和大麥中DON降低5. 5% 19%,但實際上毒素是通過浸洗過程溶解于浸液或轉移到其他副產品中，并不會真正被破壞。當前的吸附劑對于這兩種真菌毒素基本沒有效果，而且無機吸附劑還大量吸附了飼料和食品中的微量營養物質，被黏土吸附后的DON,無法被分解，會弓I起二次污染。生物降解不僅可以高效將毒素轉化為無毒產物、環保安全，而且生物酶催化方法專一性強、轉化效率高。已經成為當前真菌毒素削減技術中最有發展前景的處理技術途徑，其不僅安全、環保、高效，而且利用現代生物技術開展研究非常符合當前我國節能減排的發展趨勢。
技術實現思路
本專利技術所要解決的第一個技術問題是提供一種高效降解DON和ZEN兩種真菌毒素的工程菌。具體地，利用外源基因重組表達技術獲得可同時降解兩種毒素的工程菌，該工程菌可直接有效地應用于真菌毒素的削減.。本專利技術要解決的第二個技術問題是提供高效降解DON和ZEN兩種真菌毒素的工程菌的應用。為解決上述技術問題，本專利技術采取以下技術方案本專利技術提供一種高效降解兩種真菌毒素的工程菌，是將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因和玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因導入宿主菌中，得到可降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的工程菌。所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因和玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因可以采用現有技術中已經公開的降解酶編碼基因。進一步地，本專利技術提供了一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因和玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因，其中，所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因如序列表中SEQ ID NO: I所示，其對應的氨基酸序列如序列表中SEQID NO 2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因如序列表中SEQ ID NO 3所示，其對應的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。進一步地，所述宿主菌為酵母菌、芽孢桿菌或乳桿菌。更優選地，所述酵母菌為畢赤酵母或釀酒酵母；所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌或納豆芽孢桿菌；所述乳桿菌為嗜熱乳桿菌。本專利技術所述工程菌可以采用現有技術中已知的構建方法，包括但不限于I、通過PCR方法分別擴增獲得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因，分別插入到表達載體PPIC9K上，將含有兩種降解酶基因的混合載體通過電擊轉化畢赤酵母，得到同時表達玉米赤霉烯酮降解酶和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的畢赤酵母基因工程菌，該工程菌具有同時降解ZEN和DON兩種真菌毒素的能力。 2、通過PCR的方法，以在畢赤酵母中外分泌重組表達載體DNA為模板，擴增獲得具有外分泌功能的α交配因子核酸序列，通過雙酶切將該核酸片段插入到釀酒酵母表達載體pYES2上，隨后通過PCR方法分別擴增獲得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因，分別插入到上述新構建的含α交配因子核酸序列的釀酒酵母表達載體PYES2上；然后通過電擊轉化含有兩種降解酶基因的混合載體，得到同時表達玉米赤霉烯酮降解酶和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的釀酒酵母工程菌，該工程菌具有表達并外分泌玉米赤霉烯酮降解酶和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的能力。3、通過PCR擴增玉米赤霉烯酮降解酶基因和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因，分別連接入ΡΗΤ315載體上，獲得相應的重組表達載體，經電擊轉化芽孢桿菌或乳桿菌，獲得含有玉米赤霉烯酮降解酶基因和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因的工程菌。本專利技術還保護工程菌在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮中的應用。本專利技術的有益效果現有真菌毒素削減技術僅限于在被真菌毒素污染的原料中添加粘土、高嶺土等物理吸附劑，也僅對黃曲霉毒素有一定的吸附效果，而對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等幾乎沒有吸附效果，而且由于缺乏專一性而吸附了大量營養成分。目前為止，國內外還沒有可高效、綠色和規模化降解這兩種真菌毒素的處理技術。本專利技術的工程菌為開發綠色環保、高效，可保障產品的真菌毒素大幅削減的工藝和技術提供了優良的微生物菌株。附圖說明圖I為DON降解酶基因PCR產物電泳圖譜，M =Marker ;1_6 D0N降解酶基因PCR產物；圖2為ZEN降解酶基因PCR產物電泳圖譜，M =Marker ;1_5 =ZEN降解酶基因PCR產物；圖3為外分泌重組質粒SCWES2的物理圖譜；圖4為外分泌重組載體SCWES2雙酶切驗證圖譜，M =Marker;BiBlank; I =SCff基因PCR片段；2 :載體pYES2雙酶切片段；3 :外分泌重組表達載體SCWES2雙酶切片段圖5為DON降解酶基因重組表達載體的物理圖譜；圖6為DONase基因外分泌重組表達載體SCWTES2雙酶切鑒定圖，M =Marker; I DONase基因PCR片段；2 :重組載體SCWTES2雙酶切片段；3 :重組外分泌表達載體SCWES2雙酶切片段；圖7為ZEN降解酶基因重組表達載體的物理圖譜；圖8為ZDase基因外分泌重組表達載體SCWTES2雙酶切鑒定圖，M =Marker; I :重組外分泌載體SCWES2雙酶切片段；2 :重組表達載體SCWZES2雙酶切片段；3 =ZDase基因PCR片段；圖9為釀酒酵母轉化子的D0N\ZEN降解酶基因的PCR鑒定電泳圖譜，M =Marker ；B:Blank; 1-4 :釀酒酵母轉化子D0N\ZEN降解酶基因PCR產物； 圖10為釀酒酵母工程菌表達DON降解酶和ZEN降解酶SDS-PAGE電泳圖譜，M Marker ；B Blank ；1, 2 :釀酒酵母轉化子 SCWZT ；圖11為受體菌株INVScl在發酵時期對ZEN、DON兩種毒素的降解能力曲線；圖12為釀酒酵母重組菌株在發酵時期對ZEN、DON兩種毒素的降解能力曲線。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。但這些實施例僅限于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的保護范圍。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I :真菌毒素DON降解酶基因DONase的克隆脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因質粒文庫的建立(I)將標準菌株尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum) ACCC No本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高效降解兩種真菌毒素的工程菌，其特征在于，將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因和玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因導入宿主菌中，得到可降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的工程菌。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳子丹，孫長坡，任保中，伍松陵，
申請(專利權)人：國家糧食局科學研究院，
類型：發明
國別省市：