合成雙功能復合物的方法技術

本發明專利技術公開了一種合成包含反應產物和編碼區域的雙功能復合物的方法。該復合物是新生雙功能復合物和構件之間的雜交產物。新生雙功能復合物包含連接到寡核苷酸標識符區的連接實體，構件包含和與該標識符區足夠互補以允許雜交的寡核苷酸連接的功能實體。然后，功能實體可通過化學反應轉移到連接實體上。互補標識符區還包含獨特密碼子，它明確地標識該功能實體。該密碼子在使用酶(例如聚合酶)延伸該標識符區域時用作模板以形成獨特密碼子。獨特密碼子可用于解碼幾輪功能實體轉移后反應產物的合成歷史。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復合物的方法。本專利技術還涉及一種用于生成雙功能復合物庫的方法，一種用于鑒定具有預選性能的展示分子的方法。
技術介紹
已經開發出能夠對多肽和其它生化聚合物進行合成編碼的方法。該方法的一個例子公開于US 5，723，598，其中涉及雙功能分子庫的生成。雙功能復合物的一個部分是多肽且另一部分是包含用于編碼和鑒別已參與形成多肽的氨基酸的核苷酸序列的標識符寡核苷酸。在生成雙功能分子的庫之后，在對靶親和性方面進行分配且雙功能分子的標識符寡核苷酸部分利用PCR進行擴增。最終，PCR擴增子被測序和解碼用于鑒別具有靶親和性的多肽。雙功能復合物庫通過一種通常稱作分開-和-混合的方法而制成。該方法意味著接頭分子被分開至空間分離的隔室中并在每個隔室中在一端與特定氨基酸前體反應并在另一端通過正交化學反應添加編碼該特定氨基酸前體的核酸標簽。隨后，收集(混合)各隔室的內容物并隨后再次分開至數個隔室，用于新一輪的與氨基酸前體和核苷酸標簽的交替反應。繼續該分開-和-混合法直至多肽達到所需長度。該已有技術方法在其應用中受到局限，因為用于加入化學單元或用于加入核苷酸或寡核苷酸序列的兩種交替合成步驟之間必須存在相容的化學。根據已有技術，合成相容性問題通過在合成交替聚合物時正確選擇相容的保護基團，和通過正確選擇用于在一種生長中的聚合物保持被封閉的同時選擇性地去保護另一生長中的聚合物的方法而解決。Halpin和Harbury在WO 00/23458中建議了另一方案，其中所形成的分子不僅被核酸標簽鑒別而且被它指導。該方案也基于分開-和-混合技術，其中使用兩個或多個合成步驟得到組合庫。使用多個核酸模板，其中每個在一端具有化學反應部位點和在整個鏈中分散多個密碼子區域，每個所述密碼子區域又規定不同的密碼子。模板通過密碼子雜交至固定化探針上而分離和隨后每個鏈在化學反應部位與特定選擇的試劑反應。隨后，所有的鏈被集中并基于第二密碼子區域進行第二分配。該分開-和-混合法進行合適的次數以得到通常IO3至IO6種不同的化合物的庫。該方法的缺點在于必須提供大量的核酸模板。如果需要IO6種不同化合物的最終庫，必須合成總共IO6個核酸模板。這種合成一般麻煩或昂貴，因為核酸模板必須具有相當的長度以確保密碼子區域和探針之間足夠的雜交。在WO 02/074929中，公開了一種用于合成化合物的方法。這些化合物通過起始將包含反密碼子和反應性單元的轉移單元與具有與其相連的反應性單元的模板在允許反密碼子雜交至模板上的條件下接觸和隨后使反應性單元反應而合成。另外，該方法的缺點在于，必須起始提供大量的核酸模板。使用模板的已有技術方法的缺點在于，編碼取決于反密碼子和模板之間的鑒別。兩種寡核苷酸之間的雜交可在兩者之間存在足夠互補性時發生。有時，雜交甚至在寡核苷酸之間不存在完全匹配的情況下發生。其后果是，如果存在多個轉移單元，那么有時模板的密碼子序列不對應于實際反應的反應性單元。該不希望的后果在希望形成庫時甚至更加明顯，因為多個模板和構件被估計在反應介質中相互尋找。如果雜交步驟不完全適當，會產生被在模板上的不正確密碼子編碼的分子。這對針對該庫進行的選擇方法產生兩種主要作用。首先，具有編碼結合配體的密碼子組合的模板會在選擇過程中損失。第二，而且更重要的是，具有編碼非結合性配體的密碼子組合的模板將被富集。本專利技術的一個方面的目的是提供一種用于得到被編碼分子的非模板依賴性方法，所述方法使得多種化學能夠被應用于被編碼分子的形成，因為可避免相容的正交保護基團在被編碼分子和寡核苷酸標簽的交替形成中的應用。本專利技術在一個優選方面意欲改進以前 在密碼子鑒別過程中顯示的易錯雜交方法。另外，本專利技術的目的是減少所形成的非特異性反應產物。因此，在本專利技術的一個方面，本方法具有固有校正性質以確保表現型被基因型準確地編碼。
技術實現思路
本專利技術涉及一種用于得到包含展示分子(display molecule)部分和編碼部分的雙功能復合物的方法，其中包含化學反應部位和用于酶加入標簽(tag)的引發部位(priming site)的新生雙功能復合物在化學反應部位與一種或多種反應物反應,并且在引發部位上使用一種或多種酶給該復合物提供標識反應物的各自的標簽。酶一般是底物特異性的，因此標簽至引發部位上的酶加入不可能干擾正在形成的展示分子。因此，保護基團在編碼部分以及新生展示分子上的應用因此可被避免。但可因為其它原因需要保護正生長中的展示分子。可得到在含水和有機介質中具有活性的酶。但大多數酶在水介質中具有高于在有機介質中的活性。因此，在提供標簽之前或之后，可能需要改變介質以得到可用于反應物在化學反應部位上反應的條件。一般，展示分子部分通過一種或多種反應物和化學反應部位之間一輪以上的反應而形成。在本專利技術的某些方面，與一種或多種反應物反應和提供有各自的標簽的新生雙功能復合物進一步一次或多次與一種或多種反應物反應和向其提供各自的標識標簽，得到作為雙功能復合物的一部分的反應產物和包含標簽的標識部分，所述標識部分編碼已參與形成反應產物的反應物的身份(identity)。在本專利技術的某些方面，反應的輪或周期是指，單個反應物與化學反應部位反應且用于標識反應物的各自的標簽被提供在用于酶加入的引發部位上。在本專利技術的另一方面，一輪反應意味著多個反應物在化學反應部位上反應且用于標識一種或多個，但不必所有的，反應物的標簽被提供在用于酶加入的引發部位上。在化學反應部位上的反應和標簽的加入可按照任何順序發生，即反應可在標簽加入之后，同時，或之前發生。對順序的選擇可取決于酶種類，反應條件，和反應物種類，以及其它。新生雙功能復合物包含化學反應部位和用于標簽的酶加入的引發部位。任選地，新生雙功能復合物還包含連接部分(linking moiety),它連接化學反應部位與引發部位。連接部分可用于各種目的，如使引發部位與化學反應部位彼此相距足夠遠以允許酶進行標簽加入和提供雜交區域。在本專利技術的一個方面，連接部分是核酸序列。寡核苷酸的長度優選適用于與互補性寡核苷酸雜交，即連接部分中的核苷酸的數目合適地是8或以上。在某些實施方案中，連接部分通過間隔基連接到化學反應部位上，間隔基包含可選擇性地斷裂的接頭以使展示分子能夠在形成最終雙功能復合物之后的步驟中脫離編碼部分。新生雙功能復合物也被稱作生長中的復合物和表示待根據本專利技術方法處理的起始或中間復合物。中間復合物表示已進行一輪或多輪反應物反應和標簽加入的起始復合物。化學反應部位可包含單個或多個能夠與一種或多種反應物反應的反應基團。在某些方面，化學反應部位包含連接有一個或多個反應基團的支架(scaffold)。合適的反應基團的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，醛，和羥基基團。支架的例子包括苯并二氮雜笨類，甾族’乙內酰脲類(hydantiones)，哌嗪類，二酮哌嗪類，嗎啉類,托烷類,香豆素類,喹啉類,吲哚類，呋喃類，吡咯類，藝唑類，氨基酸前體，和噻唑類。另外，化學反應部位的反應基團可以是在可與反應物進行反應之前必須被活化的前形(pro-form)。例如，反應基團可用合適的基團保護，后者需要在可與反應物進行反應之前被去除。本說明書或權利要求中的展示分子表示已與一種或多種反應物反應的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
新生雙功能復合物，其包含：a)通過化學反應部位與反應物反應得到的反應產物，其中，化學反應部位通過連接部分與標識該化學反應部位的第一寡核苷酸標簽連接，其中，第一寡核苷酸標簽包括用于通過酶催化來加入第二寡核苷酸標簽的引發部位，b)標識反應物的第二寡核苷酸標簽，和c)互補的寡核苷酸，它雜交到所述的第一核苷酸標簽和第二寡核苷酸標簽的每一個上。

【技術特征摘要】
2002.10.30 DK 200201652;2002.12.19 DK 200201955;21.新生雙功能復合物，其包含 a)通過化學反應部位與反應物反應得到的反應產物， 其中，化學反應部位通過連接部分與標識該化學反應部位的第一寡核苷酸標簽連接， 其中，第一寡核苷酸標簽包括用于通過酶催化來加入第二寡核苷酸標簽的引發部位， b)標識反應物的第二寡核苷酸標簽，和 c)互補的寡核苷酸，它雜交到所述的第一核苷酸標簽和第二寡核苷酸標簽的每一個上。2.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，連接部分是核酸序列。3.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，連接部分中的核苷酸數目為8個或更多。4.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，連接部分通過間隔基連接到化學反應部位上，間隔基包含可選擇性地斷裂的接頭以使反應產物能脫離寡核苷酸標簽。5.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，反應產物通過共價鍵與第一核苷酸標簽連接。6.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是環加成產物。7.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是烷基化產物。8.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是芳基化產物。9.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是酰基化產物。10.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是酰胺鍵。11.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是羧酸酯鍵。12.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是磺酰胺鍵。13.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是二硫鍵。14.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是S-烷基鍵。15.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是NR-烷基鍵。16.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是O-烷基鍵。17.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是芳基-乙烯基鍵。18.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是炔-乙烯基鍵。19.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是肟鍵。20.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是亞胺鍵。21.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是雙環產物。22.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是三唑。23.權利要求5的新生雙功能復合物，其中，共價鍵是己烯。24.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，化學反應部位包含能與I種或多種反應物反應的單個反應基團。25.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，化學反應部位包含能與I種或多種反應物反應的多個反應基團。26.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，化學反應部位包含連接有一個或多個反應基團的支架。27.權利要求24-26任一項的新生雙功能復合物，其中，一個或多個反應基團選自胺基團、羧酸基團、硫基團、醛基團和羥基基團。28.權利要求26的新生雙功能復合物，其中，支架選自苯并二氮雜輩類、留族、乙內酰脲類、哌嗪類、二酮哌嗪類、嗎啉類、托烷類、香豆素類、喹啉類、吲哚類、呋喃類、吡咯類、1 唑類、氨基酸前體和噻唑類。29.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，可使用標準PCR技術擴增寡核苷酸標簽。30.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽由允許酶識別該寡核苷酸作為底物的主鏈結構組成。31.權利要求30的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽的主鏈結構是DNA或RNA。32.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，引發部位包含3’-OH。33.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，引發部位包含5’-磷酸基團。34.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽長2至100個核苷酸。35.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽長3至50個核苷酸。36.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽長4至20個核苷酸。37.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽長5至15個核苷酸。38.權利要求I的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽的核苷酸由核酸堿基部分和主鏈單元組成，其中主鏈單元由糖部分和核苷間接頭組成。39.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽的核酸堿基選自天然存在的核酸堿基以及非天然存在的核酸堿基。40.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，核酸堿基選自嘌呤雜環、嘧啶雜環、以及其雜環類似物和互變異構體。41.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤和次黃嘌呤核苷。42.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，核酸堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。43.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，主鏈單元選自44.權利要求38的新生雙功能復合物,其中，主鏈單元的糖部分是戍糖。45.權利要求44的新生雙功能復合物，其中，戊糖選自核糖、2’-脫氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亞甲基-核糖(LNA)。46.權利要求38-42任一項的新生雙功能復合物，其中，寡核苷酸標簽的核苷酸的核酸堿基連接在戊糖的I’位上。47.權利要求38的新生雙功能復合物，其中，連接寡核苷...

【專利技術屬性】
技術研發人員：PO·弗里斯克加德，T·弗朗奇，A·H·古利艾夫，M·D·倫多夫，J·費爾丁，E·K·奧爾森，A·霍爾特曼，S·N·雅克布森，C·薩姆斯，S·S·格萊德，K·B·延森，H·佩德森，
申請(專利權)人：紐韋盧森公司，
類型：發明
國別省市：