一種動物呼吸道特異性啟動子及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種動物呼吸道特異性啟動子及其應用。本發明專利技術所提供的啟動子，是下述a）或b）或c)的DNA片段：a）3′端至少含有序列表中序列1的第1701-2900位核苷酸序列，并且從序列1的第1701位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延長，得到長度為1200bp至2900bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c）在嚴格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。本發明專利技術所提供的啟動子在呼吸道細胞中特異表達目的基因，這對于培育抗呼吸系統傳染病的轉基因動物具有重要意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種動物呼吸道特異性啟動子及其應用，特別涉及一種來源于豬的動物呼吸道特異性啟動子及其應用。
技術介紹
長期以來我國的豬群存欄與產量一直處于世界領先地位。隨著養殖業規模的擴大化、集約化，動物飼養密度不斷增加，動物疫病感染狀況日益復雜，動物疫病的發生和流行嚴重制約著我國養殖業的進一步發展和壯大。當前豬場傳染病發生日益嚴重，且發病面廣、傳染快、流行蔓延迅速、死亡率極高。據資料統計，自20世紀70年代以來新增加豬傳染病有21種，其中90年代以來新增加7種。豬的多種傳染病的發生和流行，嚴重打擊了農民養豬的積極性，阻礙了養豬業的發展。通過呼吸系統傳播的疾病占絕大多數，包括豬氣喘病、 豬副嗜血桿菌病、豬鏈球菌病，豬肺疫、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、豬沙門氏菌病、豬流感、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬圓環病毒病、豬附紅細胞體病、弓形蟲病等。如果能夠通過抗病育種的方法，培育抗呼吸系統傳染病的轉基因豬，減少呼吸系統傳染病的發生，將對我國的養豬業帶來巨大的經濟效益。轉基因技術的關鍵在于使外源目的基因在轉基因動物體內穩定聞效的表達，而轉基因表達所用的啟動子起著非常重要的作用。啟動子是一段能使基因進行轉錄的DNA序列，轉錄的RNA通過進一步的翻譯和修飾形成功能蛋白質。根據啟動子作用的方式及功能不同，可以大致分為4類組成型啟動子、誘導型啟動子、組織或發育階段特異型啟動子和合成型啟動子。外源基因在組織或發育階段特異型啟動子的調控下，能夠在某些特定的組織器官中表達。如果采用呼吸道特異表達的啟動子，利用轉基因技術將抗病基因在豬呼吸道特異表達，培育出能夠抗呼吸系統傳播疾病的轉基因豬，將在豬的遺傳改良中具有重大意義。目前已有一些組織特異性啟動子被應用于植物的遺傳改良中，獲得了顯著的成效。然而豬組織特異性啟動子的研究卻相對滯后，目前報道的豬組織特異性啟動子寥寥無幾。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種動物呼吸道特異性啟動子及其應用。本專利技術所提供的動物呼吸道特異性啟動子來源于豬(Sus scrofa domasticaL.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3/端至少含有序列表中序列I的第1701-2900位核苷酸序列(LUNX1200)，并且從序列I的第1701位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1200bp至2900bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次5min. O. 5X SSC, O. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。所述啟動子的最后一位核苷酸是序列I的第2900位。所述啟動子為下述I) -5)中任一種 I)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-2900位核苷酸序列(LUNX1500),并且從序列I的第1401位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1500至2900bp的任意一個DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-2900位核苷酸序列(LUNX1700),并且從序列I的第1201位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1700至2900bp的任意一個DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第901-2900位核苷酸序列(LUNX2000)，并且從序列I的第901位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2000至2900bp的任意一個DNA片段；4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第601-2900位核苷酸序列(LUNX2300)，并且從序列I的第601位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2300至2900bp的任意一個DNA片段；5)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第301-2900位核苷酸序列(LUNX2600)，并且從序列I的第301位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2600至2900bp的任意一個DNA片段。在本專利技術的一個實施例中，所述啟動子具體為下述al)_a7)中任一種al)核苷酸序列為序列表中序列I的第1201-2900位核苷酸所示的DNA分子(LUNXI700)；a2)核苷酸序列為序列表中序列I的第1401-2900位核苷酸所示DNA分子(LUNXI500)；a3)核苷酸序列為序列表中序列I的第901-2900位核苷酸所示DNA分子(LUNX2000)；a4)核苷酸序列為序列表中序列I的第601-2900位核苷酸所示DNA分子(LUNX2300)；a5)核苷酸序列為序列表中序列I的第1701-2900位核苷酸所示DNA分子(LUNXI200)；a6)核苷酸序列為序列表中序列I的第301-2900位核苷酸所示DNA分子(LUNX2600)；a7)核苷酸序列為序列表中序列I所示DNA分子(LUNX2900)。序列表中序列I由2900個核苷酸組成，即為LUNX2900全長啟動子。而上述al)-a6)所述的啟動子為所述LUNX2900全長啟動子的5,端截短啟動子。含有所述啟動子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本專利技術的保護范圍。所述重組載體中，由所述啟動子啟動目的基因的表達。在本專利技術的一個實施例中，所述重組載體具體為在pGL3-Basic載體的多克隆位點插入所述啟動子得到的重組質粒。所述多克隆位點具體為限制性內切酶識別位點KpnI和Xhol。所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。所述表達盒由所述啟動子，由所述啟動子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述啟動子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。在本專利技術的一個實施例中，所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。所述啟動子在啟動目的基因在動物細胞表達中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。在所述應用中，所述動物細胞可為呼吸道細胞；所述呼吸道細胞進一步可為肺來源的細胞或鼻咽來源的細胞。在本專利技術的一個實施例中，所述動物細胞具體為A549細胞(人肺腺癌細胞)、LTEP-a-2細胞(人肺腺癌細胞)或CNE2細胞(人鼻咽癌細胞)。 在所述應用中，所述表達具體為呼吸道特異表達。所述啟動子在培育抗呼吸系統傳染病的轉基因動物中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。所述動物可為豬等。本專利技術利用相關生物信息學技術、分子生物學技術及轉基因技術，在豬的全基因組中找到了 LUNX的基因序列，從杜X長X大豬的基因組中克隆了豬LUNX的啟動子序列，將該啟動子序列連入pGL3-Basic載體中，將構建的質粒轉染真核細胞系，通過檢測啟動子所驅動的熒光素酶報告基因的活性確定了豬LUNX啟動子是呼吸道細胞特異性啟動子。本專利技術所提供的豬呼吸道細胞特異表達啟動子具有如下特點I、本專利技術啟動子序列來源于豬基因組，在多個真核細胞中驗證了其組織表達特異性，確定了其只在呼吸道細胞中特異表達外源基因。2、啟動子LUNX1700已去掉了本文檔來自技高網...

【技術保護點】
DNA分子，是下述a）或b）或c)的DNA片段：a）3′端至少含有序列表中序列1的第1701？2900位核苷酸序列，并且從序列1的第1701位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延長，得到長度為1200bp至2900bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c）在嚴格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。

【技術特征摘要】
1.DNA分子，是下述a)或b)或C)的DNA片段 a)3'端至少含有序列表中序列I的第1701-2900位核苷酸序列，并且從序列I的第1701位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1200bp至2900bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能； b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段； c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。2.根據權利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列I的第2900位。·3.根據權利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述I)_5)中任一種 1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1401-2900位核苷酸序列，并且從序列I的第1401位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1500至2900bp的任意一個DNA片段； 2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第1201-2900位核苷酸序列，并且從序列I的第1201位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為1700至2900bp的任意一個DNA片段； 3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第901-2900位核苷酸序列，并且從序列I的第901位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2000至2900bp的任意一個DNA片段； 4)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列I的第601-2900位核苷酸序列，并且從序列I的第601位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉文軍，楊利敏，徐磊，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：