胃癌的生物標志物及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一組指示早期胃癌的生物標志物和通過檢測這些生物標志物在血液樣品中的水平而在早期診斷胃癌的方法。檢測到由白蛋白、T-激肽原I、α-2-HS糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、阿法敏和γ-肌動蛋白組成的組中的一種或更多種蛋白生物標志物的過表達和/或檢測到由應激70蛋白、載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-IV、轉甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白組成的組中的一種或更多種蛋白生物標志物的低表達是胃癌存在的指示。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生物
更具體地說，本專利技術涉及生物標志物在胃癌的診斷和治療中的應用。
技術介紹
胃癌是世界范圍內造成癌癥相關死亡的第二大最常見因素，五年存活率低于15%。死亡率高是由于診斷受到耽擱，因為因為胃癌(例如發育異常和早期腺癌)在早期通常是沒有癥狀的。胃癌的早期診斷和手術介入對于更好的預后是關鍵的，這將五年存活率提高到50%。目前,消化道內窺鏡檢查法(strointestinal endoscopy)是診斷的金標準。然而，這是一個不舒服的程序，本身存在風險，并且操作不適合于大規模篩查。然而，目前沒有用于胃癌診斷的具有靈敏性和特異性的非侵入性檢測。確實需要鑒定出用于診斷目的的指示早期胃癌的存在的可靠的血清蛋白生物標志物(biomarker)。在后基因組時代，認識到蛋白是身體的役馬(work horse) 0不同代謝途徑都是通過蛋白來表現。因此，可以使用在胃癌早期表達的獨特且特異的蛋白作為生物標志物。從病理學上來看，癌癥的進展主要表現為癌組織中的失控生長、心血管的構建和對臨近組織的浸入。這些變化將帶來蛋白表達的伴隨性變化，包括它們的形成、集中和與其它分子的相互作用。通過利用血液和淋巴灌注到組織和器官，來自癌組織的蛋白和片段浸入循環。身體對癌癥的防御性反應還生成另外一組蛋白。因此，來自病人的血清/血漿樣品將為胃癌發生的篩查提供理想的樣品
技術實現思路
為了滿足上述需求，本專利技術鑒定出一組指示早期胃癌的蛋白生物標志物。所述蛋白生物標志物通過使用比較基因組學技術進行鑒定。該過程總結如下。通過實驗方法誘導大鼠胃癌。采取一系列的血清樣品，并通過高分辨率乳房X線照相術檢測胃損傷。目的是將所見到的可能胃損傷與血漿樣品中發現的差異化表達的蛋白關聯。還使用定制的免疫親和柱進行高豐度蛋白的移除。使用比較蛋白組學分析來尋找患有發育異常和早期腺癌的大鼠的血清中的特征性變化(characteristic alternation)。利用組織學檢查確認胃部癌發生的不同時期。最后，通過Matrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-T0F MS)來鑒定出一組血清候選生物標志物。這些生物標志物的一些還未見報道與胃癌相關。查出到表達差異化超過3倍的蛋白，并且通過膠內胰蛋白酶消化和隨后的MALDI-TOF MS成功鑒定到11種蛋白(見圖I)。本專利技術人發現的六種上調蛋白是白蛋白、T-激肽原I (KNGI)、a -2-HS糖蛋白(AHSG)、α -I-抗胰蛋白酶(ATT)、阿法敏(Afamin)和Y-肌動蛋白。另外五種下調蛋白是應激70蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AIV、轉甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白。它們的主要功能總結在圖2中。作為本專利技術的一個目的，提供了使用所鑒定到的一組蛋白生物標志物來對早期胃癌進行大規模篩查的方法。作為本專利技術的另一個目的，可以使用所鑒定到的一些蛋白生物標志物作為抗癌藥物的標靶用于治療目的。由于這一組生物標志物的表達水平上升指示胃癌的存在，因此它們可能是癌組織的必需組分。這些蛋白的破壞可能導致癌的破壞。另一方面，顯示下調的癌癥生物標志物的增強可以增強可能在癌癥狀態已經受到影響的正常途徑。在本公開內容所附的并且構成本公開內容的一部分的權利要求書中具體指出了表征本專利技術的各種新穎性特征。為了更好地理解本專利技術、本專利技術的操作優點和利用本專利技術所達到的特定目的，可以參考附圖和以下說明，其中例示并描述了本專利技術的優選的實施方式。 附圖說明圖I示出了根據本專利技術的在早期指示胃癌的上調生物標志物和下調變化。圖2總結了本專利技術的生物標志物的主要功能。圖3是示出典型2D-DIGE實驗的工作流程的圖。圖4示出了顯示大鼠H&E系的胃部的顯微照片(250倍)。圖5是顯示Ig Y (MW 180kDa)的純度的非還原性SDS-PAGE。圖6是使用大鼠血清作為樣品的10%SDS_PAGE和Western印跡。圖7顯示40mg粗制大鼠血清(左)和雙耗竭大鼠血清(流通物)(右)的代表性10%2-DE凝膠(銀染)。圖8是在18cm IPG膠條(strip)中解析的40 μ g大鼠血清樣品的蛋白組的代表性 2-DE，其中采用 pH 3-10，10% 的 SDS-PAGE0圖9是在18cm IPG膠條(strip)中解析的40 μ g大鼠血清樣品的蛋白組的代表性2-DE，其中采用pH 4-7，10%的SDS-PAGE作為第二維度。圖10是去除HAP后大鼠血清模式的代表性2-DE，其中采用印染可視化。正常(上圖)和患有腺癌的發育異常(下圖)血清樣品(40 μ g)。圖11是圖10示出的顯示一致地差異化表達超過3倍的15種蛋白的2_DE凝膠的放大區域。圖12顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發現的差異化蛋白的鑒定。(*第一個數指示通過MS分析的值，后一個數代表MS/MS分析)(向上箭頭指示在癌癥中被上調，而向下箭頭指示在癌癥中被下調)(NA :沒有獲得數據)。圖13提供免疫耗竭后標記的總共為150 μ g血清樣品的代表性2D-DIGE凝膠(pH4-7)。(A)Cy 3(D&A血清樣品)和Cy 5 (對照血清)的重疊圖.⑶分開的CyDye圖Cy2(內部標準物)、Cy 3和Cy 5。圖14是通過DeCyder分析一致地表達差異化超過3倍的11個斑點(spot)的3D圖像。圖15顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發現的差異化蛋白的鑒定，其中在免疫耗竭后進行樣品歸一化。圖16顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發現的差異化蛋白的鑒定，其中在免疫耗竭前進行樣品歸一化。圖17是顯示使用3種不同樣品制備方法鑒定到的差異化蛋白的數量㈧以及它們的身份(B)的文氏圖。圖18顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發現的差異化蛋白的身份。具體實施方式材料除非另有說明，否則所有使用的化學品均來自Sigma(USA)，并且至少是分析級 (AR)。另外，包括乙腈、甲醇和三氟乙酸在內的有機溶劑至少是HPLC級。塑料器具具有高質量，以避免聚合物滲漏。Eppendorf管是最高分析級,來自Eppendorf(USA)。動物樽型24只6周齡雄性維斯塔大鼠(Wistar rat)從中國香港大學實驗動物中心(Laboratory Animal Services Centre, LASEC)購買。將動物于標準實驗室條件下圈養在聚碳酸酯籠中，室溫為23±2° C，相對濕度為60±5%，12小時光/暗循環。讓動物自由采食和進水。所有程序都是按照香港理工大學的動物受試對象道德委員會批準(AnimalSubjects Ethics Subcommittee)的協議進行。通過 N-甲基-N’ -硝基-N-硝基胍(N-methyl-N' -nitro-N-nitroso Ruandine,MNNG)進行的胃癌誘導在2周的實驗室條件適應之后，當大鼠達到8周齡時利用MNNG進行胃癌誘導。讓實驗組中的19只大鼠每天飲用新鮮配制的含有O. 01%MNNG的水。在最初的6周每周通過口服強飼法飼喂ImL 10%的NaCl以引發由MNNG (Chen等，2004)誘導的胃部癌發生。溶本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.11 US 61/303,3611.一種估測受試對象患有胃癌的可能性的方法，所述方法包括如下步驟 (a)檢測選自由白蛋白、T-激肽原I、α-2-HS糖蛋白、α _1_抗胰蛋白酶、阿法敏和Y-肌動蛋白組成的組中的至少一種蛋白生物標志物在來自所述受試對象的檢測樣品中的過表達，和(b)檢測選自由應激70蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AIV、轉甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白組成的組中的至少一種生物標志物在所述檢測樣品中的低表達。2.根據權利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測至少兩種蛋白生物標志物的過表達，并且步驟(b)包括檢測至少...

【專利技術屬性】
技術研發人員：盧俊立，林穎淇，
申請(專利權)人：香港理工大學，
類型：
國別省市：