定量檢測組織ATP，ADP，AMP的方法技術(shù)

發(fā)明專利技術(shù)涉及一種物質(zhì)檢測方法，尤其是一種定量檢測組織ATP，ADP，AMP的方法。按照先后順序，準備試劑-配置溶液-設(shè)定色譜條件-制備標準曲線-制備供試品溶液-測定標本含量。這種方法適用范圍廣，可供臨床檢驗，科學研究，法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域中對ATP、ADP、AMP的定量測定；高效檢測組織ATP、ADP、AMP的含量，具有靈敏度高，穩(wěn)定性高，重復(fù)性高，精密度高，回收率高等優(yōu)點；此方法在10分鐘內(nèi)將組織ATP，ADP和AMP分離開來，有效的減少了雜質(zhì)的干擾；此方法中檢測所用的試劑和藥品價廉，容易制取，成本比較低，本發(fā)明專利技術(shù)檢測快速，用時短，有利于批量檢測，而且操作很簡單。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

專利技術(shù)涉及一種物質(zhì)檢測方法，尤其是一種定量檢測組織ATP，ADP, AMP的方法。
技術(shù)介紹
5'-三磷酸腺苷(Adenosine 5' -triphosphate,ATP)是體內(nèi)能量的直接來源，對人體的生理功能有著重要的影響。ATP減少會導致能量供應(yīng)不足等，使各種生理功能紊舌L甚至疾病的發(fā)生。此外，ATP是法醫(yī)學研究中鑒定死亡時間的重要指標。5' -二磷酸腺苷(Adenosine 5' -diphosphate, ADP), h' 一憐酸腺苷(Adenosine 5' -monophosphate,AMP)是ATP的降解產(chǎn)物，對體內(nèi)ATP的平衡起著重要的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)ADP，AMP增多可能會導致疲勞感增加。因此，定量檢測組織中ATP、ADP、AMP的含量對臨床診療、科學研究和法醫(yī)鑒定等有著重要的意義。目前檢測組織中ATP、ADP、AMP的含量較多，但是大多方法檢測所需時間長，操作繁瑣，結(jié)果不準確。
技術(shù)實現(xiàn)思路
專利技術(shù)的目的在于，提供一種適用范圍廣、檢測速度快、精確度高、成本低的定量檢測組織ATP，ADP，AMP的方法。專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種定量檢測組織ATP，ADP, AMP的方法，其特征在于:第一步，配置溶液:①標準品溶液的配置:用4°C預(yù)冷電阻率彡16ΜΩ. cm的超純水配置5個濃度梯度的標準品溶液;(D磷酸鹽緩沖液的配制用4°C預(yù)冷電阻率彡16ΜΩ. cm的超純水配置濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液,2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)其PH為6. 5 氫氧化鉀溶液的配制用4°C預(yù)冷電阻率> 16ΜΩ. cm的超純水配置2mol/L氫氧化鉀溶液；④高氯酸溶液的配置用4°C預(yù)冷電阻率彡16ΜΩ. cm的超純水配置濃度為0. 4mol/L的高氯酸溶液；第二步，設(shè)定色譜條件采用美國Agilent 1100高效液相色譜儀；色譜柱為Hypersil0DS2，柱溫25°C ;流動相為lOOmmol/L的磷酸鹽緩沖液-甲醇=99. 9 0. I ;流速I. OmL/min ;紫外波長為254nm ;進樣量20 μ L ;第三步，制備標準曲線取第一步配置的5個濃度梯度的標準品溶液，分別吸取20 μ L進樣，記錄色譜峰面積為縱坐標，ATP、ADP、AMP濃度為橫坐標，經(jīng)回歸分析得ATP、ADP、AMP的線性回歸方程；第四步，制備供試品溶液取出新鮮的動物組織標本，用靈敏度為0. OOOlg的電子分析天平稱重后迅速置于預(yù)冷的玻璃組織研磨器中，按溶劑體積和組織重量比為10mL/g的比例加入4°C預(yù)冷的0. 4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成組織勻漿液，漩渦混勻2. Omin，再4°C低溫離心處理15min，取上清液，用4°C預(yù)冷的2mol/L的氫氧化鉀溶液將上清液的PH值調(diào)至6. 5，之后再次4°C低溫離心處理15min，取上清液，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾后制成組織提取液，即供試品溶液，-80°C儲存待測；第五步，測定標本含量取第四步得到的供試品溶液20 μ L進樣分析，根據(jù)測得的峰面積按第三步建立的線性回歸方程分別計算供試品溶液中ATP、ADP、AMP的濃度，把測得的ATP、ADP、AMP濃度分別乘以相應(yīng)的供試品溶液體積，再除以制成該供試品溶液的組織重量，即得到單位重量的組織中ATP、ADP、AMP的含量。上述方法適用范圍廣，可供臨床檢驗，科學研究，法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域中對ATP、ADP、AMP的定量測定；高效檢測組織ATP、ADP、AMP的含量，具有靈敏度高，穩(wěn)定性高，重復(fù)性高，精密度高，回收率高等優(yōu)點；此方法在10分鐘內(nèi)將組織ATP，ADP和AMP分離開來，有效的減少了雜質(zhì)的干擾；此方法中檢測所用的試劑和藥品價廉，容易制取，成本比較低，本專利檢測快速，用時短，有利于批量檢測，而且操作很簡單。具體實施例方式本專利技術(shù)中所需要的試劑有5’ -三磷酸腺苷二鈉鹽、5’ - 二磷酸腺苷鈉鹽、5’ 一磷酸腺苷二鈉鹽(美國SIGMA公司)；甲醇(流動相B)為色譜純；超純水(實驗室自制，電阻率> 16ΜΩ. cm);高氯酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鉀均為分析純。然后按照順序先配置溶液①標準品溶液的配 置用4°C預(yù)冷的超純水配置5個濃度梯度的標準品溶液(待測樣本ATP、ADP、AMP的濃度在標準品溶液這5個濃度范圍之內(nèi))②磷酸鹽緩沖液的配制(流動相A):用4°C預(yù)冷的超純水配置濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含12mmol/L的磷酸氫二鈉和88mmol/L的磷酸二氫鈉)，2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)其PH為6. 5。用0.45 μ m微孔濾膜過濾，超聲脫氣半小時后使用。③氫氧化鉀溶液的配制用4°C預(yù)冷的超純水配置2mol/L氫氧化鉀溶液。④高氯酸溶液的配置用4°C預(yù)冷的超純水配置濃度為O. 4mol/L的高氯酸溶液。然后設(shè)定色譜條件采用美國Agilent 1100高效液相色譜儀；色譜柱為Hypersil0DS2 (4. 6mmX 150mm, 5 μ m),柱溫25°C;流動相為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液(內(nèi)含12mmol/L的磷酸氫二鈉和88mmol/L的磷酸二氫鈉，PH = 6. 5)-甲醇=99. 9 0. I (體積比)；流速I. OmL/min ;紫外波長為254nm ;進樣量20 μ L。在色譜條件下進行標準曲線的制備取上述現(xiàn)配置的5個濃度梯度的標準品溶液，分別吸取20 μ L進樣。記錄色譜峰面積為縱坐標，ATP、ADP、AMP濃度為橫坐標，經(jīng)回歸分析得ATP、ADP、AMP的線性回歸方程。最后進行供試品溶液的制備取出新鮮的動物組織標本，用靈敏度為0. OOOlg的電子分析天平稱重后迅速置于預(yù)冷的玻璃組織研磨器中，按溶劑體積和組織重量比為10mL/g的比例加入4°C預(yù)冷的0. 4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成組織勻衆(zhòng)液，鏇潤混勻2. Omin0再4°C低溫離心(4000r/min) 15min,取上清液,用4°C預(yù)冷的2mol/L的氫氧化鉀溶液將上清液的PH值調(diào)至6. 5，之后再次4°C低溫離心(4000r/min) 15min，取上清液，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾后制成組織提取液，即供試品溶液，_80°C儲存待測。進行完上述的操作流程，那么就可以進行標本含量測定取上述供試品溶液20 μ L進樣分析，根據(jù)測得的峰面積按上述建立的線性回歸方程分別計算供試品溶液中ATP、ADP、AMP的濃度。把測得的ATP、ADP、AMP濃度分別乘以相應(yīng)的供試品溶液體積，再除以制成該供試品溶液的組織重量，即得到單位重量的組織中ATP、ADP、AMP的含量。這種檢測方法，前后時間只需要10分鐘左右，相對于其他的檢測方法時間相當?shù)亩蹋?0分鐘內(nèi)將組織ATP，ADP和AMP分離開來，有效的減少了雜質(zhì)的干擾，精確度很高，其中所需要的試劑和藥品價格都比較低廉，而且容易制取，降低了實驗的成本，而且這種方法操作簡單，所以適用性很廣，可以用在各個研究領(lǐng)域里面進行，包括臨床的檢驗。權(quán)利要求1.ー種定量檢測組織ATP，ADP，AMP的方法，其特征在于第一歩，配置溶液①標準品溶液的配置用4°C預(yù)冷電阻率> 16ΜΩ. cm的超純水配置5個濃度梯度本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種定量檢測組織ATP，ADP，AMP的方法，其特征在于：第一步，配置溶液：①標準品溶液的配置：用4℃預(yù)冷電阻率≥16MΩ.cm的超純水配置5個濃度梯度的標準品溶液；②磷酸鹽緩沖液的配制：用4℃預(yù)冷電阻率≥16MΩ.cm的超純水配置濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液，2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)其PH為6.5；③氫氧化鉀溶液的配制：用4℃預(yù)冷電阻率≥16MΩ.cm的超純水配置2mol/L氫氧化鉀溶液；④高氯酸溶液的配置：用4℃預(yù)冷電阻率≥16MΩ.cm的超純水配置濃度為0.4mol/L的高氯酸溶液；第二步，設(shè)定色譜條件：采用美國Agilent？1100高效液相色譜儀；色譜柱為Hypersil？ODS2，柱溫25℃；流動相為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液？甲醇＝99.9∶0.1；流速1.0mL/min；紫外波長為254nm；進樣量20μL；第三步，制備標準曲線：取第一步配置的5個濃度梯度的標準品溶液，分別吸取20μL進樣，記錄色譜峰面積為縱坐標，ATP、ADP、AMP濃度為橫坐標，經(jīng)回歸分析得ATP、ADP、AMP的線性回歸方程；第四步，制備供試品溶液：取出新鮮的動物組織標本，用靈敏度為0.0001g的電子分析天平稱重后迅速置于預(yù)冷的玻璃組織研磨器中，按溶劑體積和組織重量比為10mL/g的比例加入4℃預(yù)冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成組織勻漿液，漩渦混勻2.0min，再4℃低溫離心處理15min，取上清液，用4℃預(yù)冷的2mol/L的氫氧化鉀溶液將上清液的PH 值調(diào)至6.5，之后再次4℃低溫離心處理15min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾后制成組織提取液，即供試品溶液，？80℃儲存待測；第五步，測定標本含量：取第四步得到的供試品溶液20μL進樣分析，根據(jù)測得的峰面積按第三步建立的線性回歸方程分別計算供試品溶液中ATP、ADP、AMP的濃度，把測得的ATP、ADP、AMP濃度分別乘以相應(yīng)的供試品溶液體積，再除以制成該供試品溶液的組織重量，即得到單位重量的組織中ATP、ADP、AMP的含量。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：余震，談善軍，
申請(專利權(quán))人：談善軍，余震，
類型：發(fā)明
國別省市：