一種基于微流控芯片的病原體檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種基于微流控芯片的病原體檢測方法。該方法以集成微磁場的微流控芯片作為反應的容器，磁球作為固相載體，鏈酶親和素修飾的量子點（SA-QDs）作為熒光標記物，在微磁場的作用下，在芯片通道中特定部位捕獲磁球，形成了微反應區，通過夾心免疫反應捕獲病原體，通過生物素與鏈酶親和素的相互作用，實現對病原體的熒光免疫定量分析。該檢測方法將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測相結合，兼具了微流控芯片的快速、高效和樣品用量小，磁免疫分析的高特異性、強可操縱性，及量子點優異的光學性質等優點，是一種多目標的，實時的病原體檢測方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，屬于化學及生物醫學領域。
技術介紹
近年來，連續爆發非典、禽流感、手足口病、甲型HlNl流感。每一次嚴重傳染性疾病的流行都給社會、經濟造成了巨大的損失，給人的生命帶來了極大威脅。目前常用的病原體檢測方法有PCR技術、培養技術、免疫酶技術(EIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。這些技術在臨床診斷中已發揮了巨大的作用，但仍存在一些缺點，大多比較耗時，處理過程復雜且成本高。建立一種快速、靈敏、特異的檢測病原體的方法是預防和控制傳染病的重要保證。 微流控芯片技術是在一塊幾平方厘米的芯片上構建化學或生物實驗室，將化學和生物實驗中說涉及到的各種樣品處理，反應，分離，檢測等集成到一起，具有微型化、自動化、樣品消耗量小、檢測效率高等優點。磁性粒子作為一個固相載體，在靶向物質識別，分離，控制給藥，分選細胞等方面具有廣泛的用途。在微流控芯片上結合磁珠技術是當前研究的熱點問題之一。由于量子點具有獨特又優越的光學性能，如消光系數大，量子產率高，激發光譜寬，發射光譜窄，亮度比傳統的熒光染料高10-100倍，光穩定性比傳統的熒光染料高100-1000倍等特點，目前已被廣泛應用于生物熒光標記。我們將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測相結合，建立了一種快速、高效、低耗，高特異性、高靈敏度、實時的病原體檢測方法，為病原體的現場檢測提供了強有力的工具。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種快速、高效的病原體的檢測方法。以集成微磁場的微流控芯片作為反應的容器，磁球作為固相載體，鏈酶親和素修飾的量子點(SA-QDs)作為熒光標記物，在微磁場的作用下，在芯片通道中特定部位捕獲磁球，形成了微反應區，通過夾心免疫反應捕獲病原體，通過生物素與鏈酶親和素的相互作用，實現對病原體的熒光免疫定量分析。在芯片上實現了病原體的分離、富集、免疫反應、分析檢測。具體的技術方案包括如下步驟 (O集成微磁場的微流控芯片的制作用軟刻蝕的方法制得微流控芯片的陽模；將兩個導磁棒固定于陽模微通道的兩側，導磁棒之間的夾角是O 180°，導磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90° ;采用原位反應成型法，將液態預聚物倒在固定導磁棒的陽模上，反應固化后，脫模成型，打進樣孔和出樣孔，然后與蓋片鍵合，即得到集成微磁場的微流控芯片(如圖1、2所示)；(2)修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球制備用乙基-碳二亞胺(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合物活化磁球表面的羧基，然后加入抗待測病原體表面蛋白的單抗，后將連有抗體的磁球分散在含有疊氮化鈉、BSA的PBS (pH 7. 4)緩沖液中，保存備用； (3)生物素化的抗病原體表面蛋白單抗的制備采用生物素化的試劑盒在HA單抗上修飾生物素，用脫鹽柱進行純化； (4)在芯片上進行磁性夾心免疫熒光反應檢測病原體首先用BSA溶液封閉芯片通道，同時在芯片的導磁棒上各放一塊永磁鐵，然后依次向通道中注入修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球、特定病原體、生物素化的抗該病原體表面蛋白單抗、鏈酶親和素修飾的量子點(SA-QDs)，每步反應后都用PBS緩沖液沖洗通道，洗掉未反應的藥品，最后通過熒光顯微鏡與光纖光譜儀進行熒光檢測。上述方案中步驟(I)中制備微流控芯片的材料為彈性體聚合物如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和熱塑性材料如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等；制 作微流控芯片用的陽模為金屬基陽模、單晶硅陽模或玻璃陽模；制作導磁捧材料為氧化鐵或硅鋼類軟磁性材料。本專利技術建立了一種基于微流控芯片、磁球、量子點的簡單快速檢測病原體的磁性熒光免疫檢測方法。將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測相結合，兼具了微流控芯片的快速、高效和樣品用量小，磁免疫分析的高特異性、強可操縱性，及量子點優異的光學性質等優點，是一種簡單、快速、高效、便攜、適合于現場檢測的方法。本專利技術可更廣泛地應用于生物和醫學科學等領域。附圖說明圖I為實施例I中的微流控芯片結構示意圖，圖中I.微流控芯片基片、2.微通道、3.導磁棒、4.永磁鐵、5.蓋片。圖2為實施例I中的縱剖面結構示意圖，圖中I.微流控芯片基片、2.微通道、3.導磁棒、4.永磁鐵、5.蓋片。圖3為實施例I中的芯片上磁性熒光免疫檢測病原體的流程示意圖。圖4為實施例2中的不同濃度H9N2磁性熒光免疫檢測的熒光圖片(a)，與對應的光譜圖(b)。圖5為實施例2中的不同濃度H9N2與熒光強度的變化趨勢圖(a)，與標準曲線圖(b)，與圖4對應。圖6為實施例2中的檢測H9N2磁性夾心免疫熒光檢測方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對照的熒光圖片(a)，與對應的光譜圖(b)。圖7為實施例2中的檢測H9N2磁性夾心免疫熒光檢測方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對照的柱狀圖，與圖6對應。圖8為實施例3中的不同濃度NDV磁性熒光免疫檢測的熒光圖片(a)，與對應的標準曲線(b)。圖9為實施例3中的檢測NDV磁性夾心免疫熒光檢測方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對照的熒光圖片(a)，與對應的柱狀圖(b)。具體實施例方式 實施例I (I)集成芯片的制作方法 運用標準的軟光刻制作技術，在潔凈平整的硅片表面甩上一層AZ50XT的光刻膠，得到一個40 μ m左右的厚度，在打印的膠片掩膜的遮蔽下用紫外線曝光，顯影，得到一個標準的凸出于娃片表面的掩膜。將兩個自制導磁棒固定于陽模微通道的兩側，導磁棒之間的夾角是O 180°，導磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90°，調和聚二甲基硅氧烷(PDMS)的預聚物質量比為10:1 (質量比)，真空排除氣泡，傾倒于掩膜之上，然后在烘箱中75°C烘3-4小時，固化后，用手術刀切開，從掩膜上面揭起，圖案就復制到PDMS上，用一個平頭的打孔針打進樣和出樣口 ；將潔凈的載玻片和具有流體通道的PDMS，放于氧等離子體中處理70s活化PDMS表面，產生大量羥基自由基，取出，將朝上的兩面扣在一起，在烘箱中75°C烘10分鐘，實現永久鍵合。 (2)修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球(Master Beads Carboxylic Acid0215, 500 nm diameter)制備 10 μ L表面為羧基功能團的超順磁性球(首先用0.01 mo I/L pH 7.4的PBS洗三次。然后將磁球分散在含 O. 10 mol/L EDAC 和 O. I mol/L NHS 的 O. 01 mol/L pH 7. 4 的 PBS 溶液中，37°C搖床上振蕩反應30 min，活化磁性球表面的羧基。接著用O. 01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次后，將其分散在180 μ L 0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液中，然后加入20 μ L0.59 mg/mL的抗特定病原體表面蛋白單抗溶液，搖床上振蕩反應2 h。反應后用0. 01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次，除去沒有反應的鏈霉親和素，然后將其分散在I mL 2%的BSA中，封閉30 min。最后用0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次，將其分散在含0. 05 %疊氮化鈉2% BSA 的 0. 01 mol/L pH 7. 4 PBS 中，4 °C 儲存備用。(3)生物素化的抗特本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于微流控芯片的病原體檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）？集成微磁場的微流控芯片的制作：用軟刻蝕的方法制得微流控芯片的陽模；將兩個導磁棒固定于陽模微通道的兩側，導磁棒之間的夾角是0～180o，導磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90o；采用原位反應成型法，將液態預聚物倒在固定導磁棒的陽模上，反應固化后，脫模成型，打進樣孔和出樣孔，然后與蓋片鍵合，即得到集成微磁場的微流控芯片；（2）？修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球制備：用乙基？[3？(二甲胺基)丙基]碳二亞胺和N？羥基琥珀酰亞胺混合物活化磁球表面的羧基，然后加入抗待測病原體表面蛋白的單抗，后將連有抗體的磁球分散在含有疊氮化鈉、BSA的PBS緩沖液中，保存備用；（3）？生物素化的抗病原體表面蛋白單抗的制備：采用生物素化的試劑盒在HA單抗上修飾生物素，用脫鹽柱進行純化；（4）？在芯片上進行磁性夾心免疫熒光反應檢測病原體：首先用BSA溶液封閉芯片通道，同時在芯片的導磁棒上各放一塊永磁鐵，然后依次向通道中注入修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球、特定病原體、生物素化的抗該病原體表面蛋白單抗、鏈酶親和素修飾的量子點，每步反應后都用PBS緩沖液沖洗通道，洗掉未反應的藥品，最后通過熒光顯微鏡與光纖光譜儀進行熒光檢測。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張志凌，張瑞巧，李安珺，龐代文，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：