純化生長因子蛋白的方法技術

一種在使用色譜的純化順序中純化生長因子蛋白的方法，特征在于：-至少一種色譜用多元樹脂進行；-所述生長因子蛋白在pH?4到6.2之間時結合至所述多元樹脂，并且所述生長因子蛋白在pH＞6.3下洗脫，并且生長因子蛋白的洗脫通過向洗脫緩沖液加入精氨酸和/或NaCl來改進。-多元樹脂步驟隨后是酵母源性親和配體樹脂步驟，這導致產物純度＞90%。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及使用色譜。從天然來源的原料中純化蛋白是一種挑戰，因為感興趣的蛋白通常僅以痕量存在并伴隨以其它生物聚合物例如脂質、蛋白或者甚至細胞片段。另外感興趣的蛋白往往與生物學功能相關聯，所述生物學功能經常在其純化方法步驟中喪失。純化生物聚合物例如蛋白質的方法的庫是很大的。除了沉淀方法，基于多種材料的色譜方法也是已知的。所述材料常常用化學部分修飾，例如有機離子、陽離子例如質子化氨或部分或完全烷基化的氨。這樣的材料用作陰離子交換劑。但是陽離子交換劑也可用于基于感興趣的蛋白的物理特性的純化方法，所述物理特性例如性狀、分子量和尤其是其電荷。可選地或聯合地使用親和色譜法。本領域已知傳統離子交換色譜樹脂(例如SP-，CM-, Q-或DEAE瓊脂糖FF離子交 換色譜樹脂)的一個缺點是蛋白質與樹脂的連接僅能在相對低鹽濃度(電導率，滲透壓濃度等)內，典型地在O. 01-0. 15M的鹽(NaCl等)濃度范圍內發生。在某些應用中存在能夠利用相對溫和的純化條件的需求，其中離子交換色譜步驟施加于所述蛋白，并在有所增加的離子強度下直接(沒有進一步稀釋)施加至色譜樹脂。增加的離子強度對蛋白溶液中的蛋白穩定性有顯著優勢；尤其在粗品蛋白制備中，像在收獲重組制備的蛋白產物或在血漿源性產物中，其中潛在的蛋白酶存在于溶液中，其可以負向影響目標蛋白。由于蛋白酶經常在生理條件下最好地工作(像在大多細胞系統中的情況)，即大約PH 7和鹽濃度為大約O. 15M。可以通過改變工作條件例如通過加入鹽和/或改變pH來抑制蛋白酶，然而，這些參數都對傳統的離子色譜步驟的性能是很重要的，并且從而經常不可能組合使用。需要提供這樣的純化方法，在所述方法的過程中可以使用使蛋白酶的影響最小化的條件。W0-A2-2008/073620公開了一種多肽生產方法，所述多肽在昆蟲細胞中用桿狀病毒表達系統生產。在一個實例中，所述昆蟲細胞培養物在補充了脂質混合物之后立即感染(例如，一小時之后感染)。從所述昆蟲細胞培養物中用這樣的方法分離多肽在純化過程的早期利用陰離子交換或混合式色譜。該方法步驟用于移除源自昆蟲細胞的多糖內切酶和蛋白酶并從而減少期望多肽由于酶降解而帶來的損失。在另一個實例中，將混合式色譜與染料配體親和色譜以連續流方式組合以允許昆蟲細胞培養物液體的快速處理和捕獲多肽。在又一個實例中，用這樣的方法從昆蟲細胞培養物液體中分離多肽在制備基本上不含多糖內切酶和蛋白水解活性的多肽溶液的單一操作單元中將中空纖維過濾、混合式色譜和染料配體親和組合。再進一步的實例中，所述分離的多肽是具有昆蟲特定糖基化方式的糖肽，其任選地用糖基轉移酶和修飾的核苷酸糖連接至修飾基團，例如聚合物(例如，PEG)。W0-A2-2009/063069公開了一種純化肽的方法，特別地但不排他地，涉及從肽溶液中移除外毒素的方法，包含用于所述方法的反應物的試劑盒和通過所述方法獲得的純化的肽。Dasari Venkata Krishna Rao等人公開了一種純化方法，其使用一種為促進rhG-CSF (重組人粒細胞克隆-刺激因子)的產量而發展的過程控制策略。在該研究中達到了 > 99%的純度和2. 18g/l的總產量。純化期間產物的分析表明去污劑移除了 72%的LPS(脂多糖)和98%的HCP (宿主細胞蛋白)而不移除核酸。半胱氨酸濃度是蛋白再折疊的關鍵參數。評估了 SEC (尺寸排阻色譜)柱中的基底高度和HETP (高度等效理論板)值并研究了其對拆分的效果。發現SEC期間的公式化對增加產物產量和節約時間和過程成本是至關重要的。Quan Bai等用強陰離子交換色譜(SAX)研究了在大腸桿菌中表達的重組人粒細胞巨噬細胞克隆刺激因子(rhGM-CSF)的純化和復性。用SAX分別研究了流動相中pH值、GSH/GSSG的濃度比和尿素濃度對rhGM-CSF的純化和復性的影響。結果顯示上述三個因子對rhGM-CSF的復性效率和質量回收具有顯著影響。流動相中加入GSH/GSSG能提高rhGM-CSF中正確的二硫鍵的形成從而增加其復性產量。另外，為了用SAX增加rhGM-CSF的質量回收，將低濃度的尿素加入流動相中以防止變性蛋白聚集。在優化條件下，僅通過一個步驟在30分鐘內使rhGM-CSF復性同時在SAX柱上純化。ShellyA. Pizarro報告了一種血管內皮生長因子(VEGF165),這是一種在體內誘導血管生成和血管滲透性有效的促細胞分裂原，并證明了對加速創傷愈合的治療應用的潛力。該報告中描述的方法涉及能夠生產大約9g的rh VEGF每升的培養基的細菌表達系統和蛋白質折疊和三個色譜步驟的下游純化方法，之后為藥物物質的制劑化。使用了高細胞密度(HCD)補料分批發酵方法以在原生質包含體中生產rhVEGF。從細胞溶解物中收獲包含體并使之經歷單一步驟的蛋白溶解和重折疊操作以提取rhVEGF用于純化。在發展包括重折疊和色譜期間的全部回收收率為30±6%。在實驗室和大尺度示范性方法中宿主細胞混雜物均被常規地清除至低于目標水平。重折疊和純化的rhVEGF的結構通過質譜來確認。N-端測序、胰蛋白酶肽作圖以及產物變體通過多重HPLC化驗來分析。Kimberly A. Kaleas公開了混合式色譜樹脂作為用于挑戰給料的純化工具越來越流行，并公開了用Capto MMC從堿性給料中選擇性捕獲重組人血管內皮生長因子(rhVEGF)工業化應用的發展。Capto MMC樹脂包含這樣的配體，其具有參與與蛋白的離子、疏水和氫鍵作用的潛力并與高交聯瓊脂糖珠基體偶聯。VEGF是涉及血管生成的關鍵生長因子并具有對創傷愈合的治療性應用。它在大腸桿菌中以包含體表達。從細胞溶解物中收獲固體，溶解rhVEGF并在pH 9. 8下在尿素和氧化還原試劑存在下溶解和重折疊。Capto MMC的獨特的混合模式特性使得能夠以最小的負載條件捕獲該堿性蛋白，并以>95%收率向下游過程傳遞濃縮池同時使宿主細胞蛋白含量降低至< 1.2%。該研究探索了負載條件和保留時間對動態結合容量的影響以及最佳純化性能的洗脫條件的開發。在評價各種洗脫緩沖液之后，L-精氨酸HCl顯示出可作為rhVEGF從Capto MMC解吸附的有效洗脫試劑，因為它成功中斷了樹脂和rhVEGF之間的多重相互作用。實驗室尺度的成果產生了成功地以商業化制造尺度實施的堅固的色譜步驟。本專利技術的一個目的是通過提供新的方法來避免現有技術中生長因子蛋白的純化方法的缺點。根據本專利技術，該目的通過以使用色譜的純化順序純化選自以下的生長因子的方法來實現克隆刺激因子(CSF)例如G-CAF (粒細胞克隆刺激因子)或粒細胞-巨噬細胞CSF (GM-CSF)、白介素3 (IL-3)、肝細胞生長因子、表皮生長因子和成纖維細胞生長因子(酸性)，其中-至少一個色譜用多元樹脂(multimodalresin)來進行-將所述生長因子蛋白在pH4-6. 2下結合至多元樹脂，和-將所述生長因子蛋白在pH> 6. 3下從多元樹脂上洗脫。本專利技術提供了這樣的方法，其中蛋白酶的影響可以被便利地最小化。使得可以在潛在存在能夠降解目標蛋白的蛋白酶的情況下在粗蛋白樣品中添加鹽和/或改變PH，并可以在沒有任何進一步的測量的情況下處理蛋白溶液并將目本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：古斯塔夫·吉爾加姆，斯特凡·溫厄，馬亞·蒂邁爾，
申請(專利權)人：奧克塔法馬股份有限公司，
類型：
國別省市：