用于增加在巴氏畢赤酵母中生產的治療性糖蛋白上的N-糖基化位點占據的方法技術

描述了一種與在沒有如本文所述修飾的重組宿主細胞中生產的治療性糖蛋白的N-糖基化位點占據相比，增加在如本文所述修飾且遺傳地工程改造成表達糖蛋白的重組宿主細胞中生產的治療性糖蛋白的N-糖基化位點占據的方法。具體地，所述方法會在編碼內源OTase復合物的宿主細胞基因的表達存在下，提供過表達異源單亞基寡糖基轉移酶的重組宿主細胞，在具體實施方案中，所述異源單亞基寡糖基轉移酶能夠在功能上抑制酵母寡糖基轉移酶(OTase)復合物的至少一種必需蛋白(例如，碩大利什曼原蟲STT3D蛋白)的致死突變表型。所述方法可用于在低等真核生物細胞(諸如酵母和絲狀真菌)中和在高等真核生物細胞(諸如植物和昆蟲細胞和哺乳動物細胞)中生產具有增加的N-糖基化位點占據的治療性糖蛋白。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于増加在巴氏畢赤酵母中生產的治療性糖蛋白上的N-糖基化位點占據的方法相關申請的交叉參考參考電子形式提交的序列表
技術介紹
(I)專利
本專利技術涉及與在沒有根據本專利技術修飾的重組宿主細胞中生產的治療性糖蛋白的N-糖基化位點占據相比，増加在根據本專利技術修飾的且遺傳地工程改造成表達糖蛋白的重組宿主細胞中生產的異源糖蛋白的N-糖基化位點占據的方法。具體地，本專利技術提供了過表達異源單亞基寡糖基轉移酶的重組宿主細胞，在具體實施方案中，所述異源單亞基寡糖基轉移酶能夠在有宿主細胞的內源寡糖基轉移酶(OTase)復合物存在下在功能上抑制酵母寡糖基轉移酶(OTase)復合物的至少ー種必需蛋白的致死突變表型，也提供了使用這些宿主細胞來生產異源糖蛋白的方法。(2)相關技術的描述生產重組人蛋白質的能力已經引起人類健康護理的重大進步，并且仍然是活躍的藥物發現領域。許多治療性蛋白需要在翻譯后將聚糖添加至蛋白質的特定天冬酰胺殘基(N-糖基化)上，以確保適當的結構-功能活性以及隨后在人血清中的穩定性。對于在人類中治療性用途，糖蛋白需要人樣N-糖基化?？赡M人樣糖蛋白加工的哺乳動物細胞系(例如，中國倉鼠卵巣(CHO)細胞、人視網膜細胞)具有ー些缺點，包括低的蛋白質效價、長的發酵時間、異質產物以及連續的病毒抑制。因此，希望使用這樣的表達系統其不僅在短的發酵時間內產生高蛋白質效價，而且可以生產人樣糖蛋白。就治療性蛋白表達而言，真菌宿主諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或甲基營養酵母諸如巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)具有獨特優點，例如，它們不會分 泌大量內源蛋白，可利用強誘導型啟動子來生產異源蛋白，它們可以在確定的化學培養基中生長，且不需要使用動物血清，它們可以生產高效價的重組蛋白(Cregg等人，FEMSMicrobiol. Rev. 24 :45-66 (2000))。但是，在酵母中表達的糖基化蛋白通常含有額外的甘露糖糖類，它們產生“高甘露糖型”聚糖。因為這些高甘露糖型N-聚糖當被施用給某些個體時可以導致不利應答，酵母通常尚未用于生產意圖用于人類的治療性糖蛋白。但是，在美國專利號7，029，872和7，449，308中描述了遺傳地工程改造酵母來生產人樣N-聚糖的方法，在美國公開的申請號 20040230042、20050208617、20040171826、20050208617 和 20060286637中也描述了所述方法。這些方法已經被用于構建可以生產治療性糖蛋白的重組酵母，所述治療性糖蛋白在其上面主要具有人樣復雜型或雜合型N-聚糖，而不是酵母型N-聚糖。已經發現，盡管遺傳地工程改造的酵母可以生產具有哺乳動物或人樣N-聚糖的糖蛋白，在糖蛋白上的N-聚糖附著位點的占據寬泛地變化，且通常低于這些相同位點在哺乳動物細胞生產的糖蛋白中的占據。就在巴氏畢赤酵母中生產的不同重組抗體而言，已經觀察到該現象。但是，也已經在哺乳動物細胞中觀察到N-聚糖附著位點的占據的變異 生。イ列5ロ，Gawlitzek 等人，Identification of cell culture conditions to controlN-glycosylation site-occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHOcells, Biotechnol. Bioengin. 103 :1164-1175(2009)公開稱，就在 CHO 細胞中生產的特定糖蛋白的特定位點而言，N-糖基化位點占據可以變化，且可以修改生長條件，以控制在這些位點處的占據。國際公開的申請號W02006107990公開了ー種使用多萜醇-連接的寡糖合成途徑來提高真核細胞的蛋白N-糖基化的方法。Jones等人,Biochim. Biophys. Acta. 1726 121-137(2005)已經綜述了 N-糖基化位點占據的控制。但是，仍然需要増加在重組宿主細胞中生產的治療性蛋白的N-糖基化位點占據的方法。
技術實現思路
本專利技術提供了一種在如本文所述修飾的重組宿主細胞中生產治療性糖蛋白的方法，其中在如本文所述修飾的宿主細胞中生產的糖蛋白的N-糖基化位點占據增加，超過了在沒有如本文所述修飾的宿主細胞中生產的相同糖蛋白的N-糖基化位點占據。例如，在如本文所述修飾的酵母宿主細胞中，在其中生產的糖蛋白的N-糖基化位點占據與在重組哺乳動物或人細胞中生產的相同糖蛋白的N-糖基化位點占據相同或更相似。為了增加在重組宿主細胞中生產的糖蛋白上的N-糖基化位點占據，在所述宿主細胞中表達所述糖蛋白之前或同時，在所述重組宿主細胞中過表達ー種或多種異源單亞基寡糖基轉移酶(OTase)。在具體方面，至少ー種異源單亞基寡糖基轉移酶能夠在功能上補償構成內源性的宿主細胞異源寡聚的寡糖基轉移酶(OTase)復合物的ー個或多個必需亞基的致死突變。碩大利什曼原蟲(Leishmania major) STT3D蛋白是異源單亞基寡糖基轉移酶的ー個實例，其已經被證實會抑制釀酒酵母中的STT3基因座和至少ー個選自下述的基因座的致死突變:WBP1、OSTU SffPl 和 0ST2 (Naseb 等人，Molec. Biol. Cell 19 3758-3768(2008))。一般而言，在有構成宿主細胞的內源OTase復合物的蛋白(包括宿主細胞的內源STT3蛋白)存在下，組成性地或誘導性地過表達所述ー種或多種異源單亞基寡糖基轉移酶。編碼所述異源單亞基寡糖基轉移酶基因的表達盒可以整合進宿主細胞基因組內的任意位點中，或位于宿主細胞的染色體外間隙中，即，自主復制的遺傳元件，諸如質粒、病毒、2 μ m質粒、微型染色體等。在具體實施方案中，一種或多種單亞基寡糖基轉移酶是利什曼原蟲屬的種的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或它們的組合。在具體實施方案中，所述一種或多種單亞基寡糖基轉移酶是碩大利什曼原蟲STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或它們的組合。在沒有編碼構成宿主細胞的OTase復合物的蛋白(包括宿主細胞STT3蛋白)的內源基因的表達存在下，不過表達編碼單亞基寡糖基轉移酶的核酸分子。相反，在編碼構成宿主細胞的內源寡糖基轉移酶(OTase)復合物的蛋白的基因的表達(包括編碼宿主細胞的STT3的內源基因的表達)存在下，組成性地或誘導性地過表達單亞基寡糖基轉移酶的核酸分子。編碼單亞基OTase的每個表達盒可以整合進宿主細胞基因組內的任意位點中，或位于宿主細胞的染色體外間隙中，即，自主復制的遺傳元件，諸如質粒、病毒、2 μ m質粒、微型染色體等。在本文中已經使用巴氏畢赤酵母宿主細胞例證了本專利技術，所述宿主細胞被遺傳地工程改造成生產哺乳動物或人樣復雜型N-聚糖；但是，本專利技術可以應用于其它酵母或絲狀真菌宿主細胞，具體地，遺傳地工程改造成生產哺乳動物或人樣復雜型或雜合型N-聚糖的酵母或絲狀真菌，以提高在所述酵母或絲狀真菌宿主細胞中生產的糖蛋白的總N-糖基化位點占據。在其它方面，所述宿主細胞是生產重組異源蛋白的酵母或絲狀真菌，所述重組異源蛋白具有野生型或內源性的宿主細胞N-糖基化模式，例如，高甘露糖基化的或高甘露糖型本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：N塞圖拉曼，崔秉權，B普林斯，M米爾，TA斯塔黑姆，
申請(專利權)人：默沙東公司，
類型：
國別省市：