本發明專利技術公開了一種產角蛋白酶大腸桿菌基因工程菌及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明專利技術采用重組DNA技術將地衣芽胞桿菌Bacillus?licheniformis?BBE11-1的角蛋白酶（ker）基因克隆連接到大腸桿菌表達載體pET?22b(+)，并轉化Escherichia?coli?BL21(DE3)，經篩選鑒定得到一株可以產較高角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Escherichia?coliBL21(DE3)-pET22b(+)-ker，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012180。該菌株表達的角蛋白酶酶活為256U/mL，這為角蛋白酶的大規模生產奠定了良好的基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種產角蛋白酶的基因工程菌及其應用，屬于基因工程
技術介紹
角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產生。羽毛作為家禽飼養和屠宰工業的副產物每年產量巨大，且蛋白質和氨基酸含量豐富，是潛在的優良蛋白質資源。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對環境的污染，同時可以作為一種飼科蛋白質應用于畜禽的飼養。在傳統利用羽毛過程中主要采用酸堿水解。熱降解等方法，前者存在污染環境問題，后者對能源消耗比較大，且可以破壞部分氨基酸，降低了產品的營養價值。其他常見的角蛋白為動物的毛發，如牛毛、羊毛和人發等，這類角蛋白質部分作為商業原料進行加工外，其余多作為廢物處理，也造成了 環境的污染和蛋白資源的浪費。角蛋白酶能使角蛋白降解為多肽和氨基酸，既可用于農業肥料的生產，又可作為畜禽的飼料蛋白源；角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，其在皮膚病治療方面的研究還有待于進一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”導致瘋牛病和人類克雅氏癥的毒蛋白，從而可應用于醫療和實驗儀器的凈化；它還可用于皮革脫毛鞣制，配制潤膚露、浴皂、洗發水和脫毛膏等美容品。目前關于角蛋白酶的研究主要集中于生產菌株的篩選以及相關酶性質的研究。然而，在這些角蛋白酶產生菌中只有很少的菌株具有商業開發價值。在異源宿主中表達也存在許多問題需要解決，如表達蛋白以包涵體形式出現；這種異源表達的蛋白有時會對宿主菌產生毒性，限制宿主菌的生長，而且，在表達量積累的過程中，這種堿性蛋白酶還會造成自身的降解；構建的重組質粒有時很不穩定，在表達過程中容易丟失，這樣就造成蛋白表達量的降低或消失。構建合適的載體和選擇正確的宿主是這類蛋白表達的關鍵。
技術實現思路
本專利技術提供了一種產角蛋白酶大腸桿菌基因工程菌，已于2012年5月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC NO M2012180，分類學命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)-pET22b (+)-ker。本專利技術還提供了一種應用所述基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法，以產角蛋白酶基因工程菌為生產菌株，斜面活化制備種子，在種子0D_在2. 5時以3%的接種量轉入基本發酵培養基，于20°C、200rpm條件下培養；當OD值再為2. 5時，降低發酵溫度到20°C誘導30小時，IPTG濃度為O. 05mM ;種子和斜面培養基為LB培養基；基本發酵培養基成分為去離子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高壓滅菌，冷卻至60°C，加IOOmL滅菌磷酸鉀緩沖液。角蛋白酶酶活測定方法將發酵液離心IOmin (10000X g，4°C )取發酵上清液，吸取200uL適當稀釋的酶液，加入300uL O. 05mol/L gly-NaOH緩沖液(pH9. O)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培養15min，加入500uL 4M TCA溶液以終止反應。離心lOmin，吸取200uL上清液移入到新的試管中，后依此加入ImL福林酚試劑和200uL O. 5M Na2CO3后50度顯色15min。空白為在加入酶液的同時，加入500uL TCA溶液，經過相同過程反應的過濾清液作為空白。在660nm處檢測吸光值,根據酪氨酸標準曲線定義每15min內釋放Iug酪氨酸定義為一個酶活單位。以本發提供的基因工程菌，在發酵結束后該菌株表達的角蛋白酶酶活為256U/mL，為角蛋白酶的大規模生產奠定了良好的基礎。生物材料樣品保藏一株高產角蛋白酶大腸桿菌基因工程菌，命名為EscherichiacoliBL21(DE3)-pET22b(+)-ker，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M2012180，保藏日期為2011年5月23日。附圖說明圖I :(a)目的基因的擴增。 M DL 2,000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :ker基因的PCR擴增條帶;(b)菌落PCR挑選陽性重組子。M DL 2，000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :陽性重組子；圖2 :(a)重組質粒的提取。M:DL 10,000 DNA Marker ;泳道I和泳道2 :重組質粒 pET22b (+)-ker ; (b)雙酶切驗證。M :DL 10, 000 DNA Marker ;泳道 I :重組質粒pET22b(+)-ker ；泳道2 :重組質粒用Nco I和Xho I雙酶切后得到的條帶。圖3 :蛋白電泳(SDS-PAGE )實驗結果。M:蛋白質分子量標準(Protein Molecular Weight Marker) ;1 :含質粒pET22b (+)重組菌；2 :含質粒pET22b (+) -ker重組菌。具體實施例方式實施例I重組菌的構建及鑒定I)根據NCBI網站基因序列設計(GenBank: S78160. 1)，引物序列如下kerl-F:5， ~CATGCCATGGATGCTCAGCCGGCGAAAAAT~3Jkerl-R:5， -CGCCTCGAGTTATTGAGCGGCAGCTTCGA-3’以地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBEl (已在本單位專利號為201110343655. 5的專利申請中保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011319)基因組為模板，克隆角蛋白酶基因。PCR反應體系0. 2mL PCR管中按順序加入以下試劑5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+Plus) 5μ I; DNTP Mixture 4 μ I;模板 DNA I μ I ;上下游引物各 I μ I ；Taq 酶0.5 μ I ;加雙蒸水至終體積為50 μ I。PCR擴增條件94°C預變性5min ;94°C變性30s,61°C退火 15s，72。。延伸 Imin 20s (30 個循環);72°C延伸 IOmin02)以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證并以O. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物，結果擴增得到與文獻報道大小相符的ker基因片段(圖Ia-泳道I、泳道2)。3)用限制性內切酶Nco I和Xho I雙酶切消化純化后的ker基因和載體pET22b(+)，用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液涂布在含有氨芐青霉素(lOOmg/mL)的LB平板上，37 °C過夜培養，以ker I-F和kerl-R為引物進行菌落PCR的方法鑒定陽性克隆子(圖Ib-泳道I、泳道2)，最終獲得含有ker基因的重組表達質粒pET22b(+)-ker (圖2a_泳道I、泳道2)，用雙酶切進行驗證(圖2b-泳道2)。大腸桿菌化學轉化為取連接產物5μ I加入到含有ΙΟΟμ I JM109感受態細胞中，充分混勻后，冰浴30min ;將裝有混合物的Eppendorf管，42°C水浴熱休克90s，然后將Eppendorf管立即轉移到冰上冷卻2min ；向管中加入600 μ I LB液體培養基,置于370C 200rpm恒溫搖床 上培養lh，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37°C向上放置lh，倒置培養12-16本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種產角蛋白酶大腸桿菌基因工程菌，于2012年5月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC？NO：M？2012180。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳堅，劉柏宏，張娟，堵國成，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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