本發(fā)明專利技術(shù)涉及相對于其親本酶具有改善的針對螯合劑的穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體，包含所述變體的組合物，編碼所述變體的核酸，產(chǎn)生所述變體的方法和使用所述變體的方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及與其親本酶相比針對螯合劑具有改善的穩(wěn)定性的α -淀粉酶變體，包含所述變體的組合物，編碼所述變體的核酸，產(chǎn)生所述變體的方法，和使用所述變體的方法。
技術(shù)介紹
α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解?！う?-淀粉酶在例如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化，如在制備高果糖糖漿或作為從淀粉產(chǎn)生乙醇的一部分中，具有悠久的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用歷史。許多這些和其他的α-淀粉酶應(yīng)用使用來源于微生物的α-淀粉酶，特別是細(xì)菌α-淀粉酶。首先使用的細(xì)菌α -淀粉酶中包括來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也稱作Termamyl,其已經(jīng)得到廣泛表征并已經(jīng)確定了該酶的晶體結(jié)構(gòu)。堿性淀粉酶，如源自披露于WO 95/26397中的芽孢桿菌屬菌種的α -淀粉酶，形成了用于洗滌劑的特定的α-淀粉酶組。已經(jīng)對很多這些已知的細(xì)菌淀粉酶進(jìn)行了修飾，以改進(jìn)它們在具體應(yīng)用中的功能性。Termamyl和很多高效α -淀粉酶的活性都需要|丐。發(fā)現(xiàn)Termamyl的晶體結(jié)構(gòu)中四個(gè)鈣原子通過帶負(fù)電荷的氨基酸殘基配位結(jié)合在α-淀粉酶結(jié)構(gòu)中。在其他α-淀粉酶中，結(jié)合在結(jié)構(gòu)中的鈣離子的量可能不同。對于鈣的需要在存在強(qiáng)螯合化合物的應(yīng)用中，如在洗滌劑或從全谷物產(chǎn)生乙醇的過程中是缺點(diǎn)。如上所述，眾所周知多種酶依賴于鈣或其他金屬離子如酶或鋅以供其活性和穩(wěn)定性，因此在包含螯合劑的組合物，例如含有螯合劑的洗滌劑或供用于產(chǎn)生生物燃料、其中植物材料或含淀粉材料具有天然螯合劑成分如例如植酸的組合物中開發(fā)既穩(wěn)定又顯示良好性能的酶是一個(gè)挑戰(zhàn)。舉例而言，添加或摻入螯合劑以在洗滌過程中降低水硬度，保護(hù)可能還存在的漂白劑，且螯合劑亦對一些污跡的去除具有直接作用。鈣依存性酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性有時(shí)可通過將鈣添加至該洗滌劑而改善，但常常這樣做會(huì)隨即破壞污跡去除作用。此外，將鈣添加至液體洗滌劑可導(dǎo)致配制上的問題，即洗滌劑的物理穩(wěn)定性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
因此，提供如下α -淀粉酶的組合物和變體會(huì)是有利的，其對于螯合劑是穩(wěn)定的，并優(yōu)選與親本α-淀粉酶相比具有得到保持或提高的洗滌性能。因此，本專利技術(shù)的第一個(gè)方面涉及組合物，其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體在選自使用根據(jù) SEQ ID Ν0:6 編號(hào)的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和243的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并且還包含至少一種螯合劑，其中當(dāng)在21°C和pH 8. O測量時(shí)，所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠?qū)⒂坞x鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。另一個(gè)方面涉及組合物，其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體在選自使用根據(jù) SEQ ID Ν0:6 編號(hào)的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和 243 的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并且還包含至少一種螯合劑，其中當(dāng)在21°C和pH 8. O測量時(shí)，所述螯合劑能夠在低于O. 9倍能夠?qū)⑩}離子的濃度從2. OmM減少至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的螯合劑濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至O. 10mM。本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及用于制備多肽的方法，包括(a)提供具有淀粉酶活性的親本多肽的氨基酸序列；(b)選擇占據(jù)對應(yīng)于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的一個(gè)或多個(gè)位置的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，并進(jìn)一步選擇對應(yīng)于位置116、 118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458的一個(gè)或多個(gè)位置；(c)通過取代或缺失選定的氨基酸殘基或鄰接選定的氨基酸殘基插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來修飾所述序列；(d)產(chǎn)生具有修飾序列的變體多肽；(e)測試所述變體多肽的淀粉酶活性和穩(wěn)定性；和(f)選擇在螯合劑存在下相對于親本多肽穩(wěn)定性增加并具有淀粉酶活性的變體多肽，其中在21°C和pH 8. 0，所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠?qū)⒂坞x鈣離子的濃度從2. OmM 減少至 O. IOmM0在一個(gè)優(yōu)選的方面，本專利技術(shù)涉及親本α -淀粉酶的變體，所述變體在對應(yīng)于選自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位置的一個(gè)或多個(gè)位置包含改變，并進(jìn)一步在對應(yīng)于選自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的位置的一個(gè)或多個(gè)位置包含改變，其中(a)所述各改變獨(dú)立地為(i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位置的氨基酸，和/或(iii)取代占據(jù)該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性；并且(c)每個(gè)位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。在另一個(gè)方面，本專利技術(shù)涉及親本α-淀粉酶的變體，所述變體在181、182、183或184的氨基酸區(qū)中包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或至少三個(gè)缺失，并進(jìn)一步在選自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的一個(gè)或多個(gè)位置包含改變，并進(jìn)一步在選自116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的一個(gè)或多個(gè)位置包含改變，其中(a)所述各改變獨(dú)立地為(i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位置的氨基酸，和/或(iii)取代占據(jù)該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性；并且(c)每個(gè)位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。本專利技術(shù)進(jìn)一步涉及編碼本專利技術(shù)的變體的分離的核苷酸序列和包含編碼本專利技術(shù)的變體的核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞。專利技術(shù)詳述定義 α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。已知α -淀粉酶來源于廣泛選擇范圍的生物，包括細(xì)菌，如來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的種，例如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),來自真菌的種，如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillusniger);來自植物如大麥和來自哺乳動(dòng)物。野生型酶術(shù)語“野生型” α-淀粉酶指由天然存在的微生物，如見于自然界的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌表達(dá)的α-淀粉酶。當(dāng)親本酶并非變體酶時(shí)，術(shù)語“野生型酶”和“親本酶”可互換使用。變體酶術(shù)語“變體”在本文中定義為具有α -淀粉酶活性的多肽，其在親本或野生型α-淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)(或一個(gè)或幾個(gè))特定位置包含一個(gè)或多個(gè)(或一個(gè)或幾個(gè))氨基酸殘基的改變，如取代、插入和/或缺失。優(yōu)選少于50個(gè)修飾，更優(yōu)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：A斯文森，AH約翰森，ME比約恩瓦德，FW拉斯馬森，M斯科約特，SE拉森，J奧布羅，S卡斯嘉德，L貝耶爾，
申請(專利權(quán))人：諾維信公司，
類型：
國別省市：
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