苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒制造技術

本實用新型專利技術公開了一種苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體，包裝盒體內的一側設有口腔拭子，另一側設有樣本保存管、含有PCR擴增試劑的試管、含有PCR產物純化試劑的試管和含DNA測序試劑的試管。本實用新型專利技術將樣本采集、苯丙酮尿癥致病基因突變位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便快捷，且成本更低。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本技術提供了一種苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒，屬于分子生物學

技術介紹
苯丙氛酸輕化酶(phenylalaninehydroxylase, PAH)基因定位于染色體12q22-24. 2，全長約90kb，包括13個外顯子和12個內含子。外顯子長為1353bp的單鏈，mRNA翻譯成含451個氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的PAH酶。PAH基因突變可導致肝臟苯丙氨酸羥化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常轉化為酪氨酸，從而在肝臟中代謝紊亂，導致患兒出現苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)。苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病。在歐美地區的發病率為1/10000，在我國是1/16000，雜合子頻率為1/50。迄今已經發現PKU有440多種致病突變，國內僅發現30余種突變。PAH基因的突·變大部分是錯義突變，致病突變大多位于外顯子或內含子與外顯子的交接區，嚴重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉錄和翻譯及蛋白質的異常折疊、聚合，以及加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。在不同種族和地區人群之間苯丙氨酸羥化酶基因座突變部位及分布具有較大差異。中國北方人群PAH最常見的突變是R243Q (22. I % )，其次是EX6-96A > G、R111X、R413P和Y356X。而臺灣PKU的發病率和突變圖譜與大陸存在很大的差異，臺灣中以輕型PKU為主，突變以R241C和R408Q最常見，發生率分別為32%和14% ;其次是R243Q，其在臺灣人群的發病率低于大陸人群的發病率。
技術實現思路
本技術的目的是提供一種檢測苯丙酮尿癥致病基因PAH是否發生突變的試劑盒。為實現以上目的，本技術提供了一種苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體，包裝盒體內的一側設有口腔拭子，另一側設有樣本保存管、含有PCR擴增試劑的試管、含有PCR產物純化試劑的試管和含DNA測序試劑的試管。本技術將樣本采集、苯丙酮尿癥致病基因突變位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便快捷，且成本更低。本技術基于直接測序技術，可以對PCR產物直接進行DNA序列分析，明確突變位點，是現有基因突變檢測方法中最直接最準確的方法，且可以實現機械化自動化，使測序工作更加簡便快捷，結果判讀更直觀。附圖說明圖I為本技術提供的一種苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒結構示意圖；圖2為PAH基因第7號外顯子實驗無突變的結果示意圖；圖3為PAH基因第7號外顯子實驗有突變的結果示意圖。具體實施方式為使本專利技術更明顯易懂，茲以優選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。實施例如圖I所示，為本技術提供的一種苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒的結構示意圖，包括帶盒蓋的包裝盒體1，包裝盒體I靠近盒蓋的一側，即包裝盒體I的后側放置有口腔拭子2，前側放置四個2X2排列的試管，分別是位于左后的樣本保存管3、位于右后的含有PCR擴增試劑的試管4、位于左前的含有PCR產物純化試劑的試管5和位于右前的含DNA測序試劑的試管6。測試步驟如下步驟I :采集檢測樣品用口腔拭子2在被測者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的細胞樣本，采集完畢，樣本保存于樣本保存管3中。步驟2 :采用硅膠吸附法抽提樣本的基因組DNA。步驟3:PCR擴增PCR 擴增試劑(總體積為 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL (PH8. O)、IOOmM KCL,500uM dNTPs、3mM MgC12 溶液、0. IU Taq DNA 聚合酶/ul。苯丙氨酸羥化酶(PAH)檢測引物信息如下第I對引物擴增PAH外顯子IPAH-IF cctcctgcgtcaggacaac ；PAH-IR :ttcgttggaagctgatgagaa。第2對引物擴增PAH外顯子2PAH-2F ttgctttftccatggaggttt ；PAH-2R :acaggatctggaacaggcaga。第3對引物擴增PAH外顯子3PAH-3F tgtgaactaactgccccacct ；PAH-3R :ttgctgttattttgcggaagc。第4對引物擴增PAH外顯子4PAH-4F gggatccccacttctgatctc ；PAH-4R :aacaactctgccaactgcagg。第5對引物擴增PAH外顯子5PAH-5F cccccattcaaagcattcata ；PAH-5R :cattcaagatttcaggccagc。第6對引物擴增PAH外顯子6PAH-6F ccctttcatgtgggaaatcaa ；PAH-6R :gtgcttgtaggaatgcatgca。第7對引物擴增PAH外顯子7PAH-7F atgtccctgggcagttatgtg ；PAH-7R :tgagaacaggaacaagtggca。 第8對引物擴增PAH外顯子8PAH-8F gggagcatgtccacaggaata ；PAH-8R :tatgatcccacctgaaatggg。第9對引物擴增PAH外顯子9PAH-9F ggccacccatcacctttttat ；PAH-9R :gtagcccttgaaaacccttgg。第10對引物擴增PAH外顯子10PAH-10F tcccttcatccagtcaaggtg ；PAH-10R :attccaaggctgacctatgca。第11對引物擴增PAH外顯子11PAH-IlF cagcatttgggctgtgatgta ；PAH-IlR :cgttctctgttggaaggttgg。第12對引物擴增PAH外顯子12PAH-12F accctgctctagggaggtgtc ；PAH-12R :cctctccatcccttctacgct。第13對引物擴增PAH外顯子13PAH-13F agcccacttatcccctagtgc ；PAH-13R :atttgggacctgcttcattca。然后在ABI9700型PCR擴增儀上進行檢測，分為13個反應孔，每個反應孔分別放入上述13對PAH引物，每對正反向引物各O. 5ul (引物濃度為lOumol/L)，各加入檢測樣品2ul，PCR反應液7. 5ul，去離子水4. 5ul，反應孔總體積15ul。反應條件為95°C預熱10分鐘；再進行35個循環的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分鐘后，降溫至4°C。 步驟4 =PCR產物純化每一個反應孔反應體系總體積為7ul，由PCR產物純化試劑4ul和PCR產物3ul組成。反應條件為37°C、60分鐘；80°C、15分鐘。步驟5 DNA測序反應每一個反應孔反應體系總體積為5ul，由PCR純化產物Iul、DNA測序試劑Iul、測序引物Iul和去離子水2ul組成。反應條件為96°C2分鐘；25個循環的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分鐘；60°C、4 分鐘。反應結束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和無水乙醇15ul，室溫沉淀15分鐘；3650轉/分，4°C離心30分鐘，輕輕倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650轉/分，4°C離心15分鐘，倒去上清液；室溫放置20分鐘后本文檔來自技高網...

【技術保護點】
苯丙酮尿癥致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體(1)，包裝盒體(1)內的一側設有口腔拭子(2)，另一側設有樣本保存管(3)、含有PCR擴增試劑的試管(4)、含有PCR產物純化試劑的試管(5)和含DNA測序試劑的試管(6)。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張奕，傅詠南，王校，
申請(專利權)人：上海中優醫藥高科技有限公司，
類型：實用新型
國別省市：