本發明專利技術為一種Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。通過實驗研究結果顯示，通過Klotho基因轉導可以控制SHR大鼠血壓進一步升高，減輕高血壓心臟病心臟損害即可以保護SHR大鼠心臟，至少可以持續12周，Klotho腺相關病毒完全可以作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物對高血壓及相關心血管疾病進行治療。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體的說，涉及一種Klotho腺相關病毒的新用途。
技術介紹
研究表明高血壓病及其相關的心血管疾病已成為危及人群健康的常見病；而老年人因罹患心血管病而致的死亡明顯高于年輕人。因此，高血壓病以及相關心血管并發癥與衰老密切相關，也是影響其預后的重要因素。已有研究證實自發性高血壓(spontaneoushypertensive rat, SHR)大鼠具有許多人類自發性高血壓的特征,是一種很好的高血壓模型動物，其血壓水平有隨年齡增長而增高的特點，常伴發心、腎及血管等靶器官損傷，其中高血壓心臟病以心肌肥大、心肌纖維化、心室重塑等損害更為重要。 Klotho基因作為一種于1997年被KuiX)等人發現的新型衰老相關基因，其研究發現在Klotho基因敲除小鼠模型上Klotho可以抑制多種類似人類衰老相關表型，如動脈硬化、骨質疏松、生殖功能減退、肺氣腫、壽命縮短等。而Klotho的過表達可以延長壽命。研究發現Klotho基因可以抑制胰島素IGF-I信號通路，增加NO活性，調節離子通道活性。Klotho還可以對抗內皮功能障礙。肖明能等研究報道40歲以后血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而有下降趨勢。Wang等報道Klotho在體內的基因轉導可以阻止高血壓的進程和保護腎臟功能。但就Klotho在心臟靶器官損傷中是否也發揮了作用，以及是否對高血壓心臟病有治療作用，目前尚未見報道。
技術實現思路
為解決以上技術問題，本專利技術的目的在于提供一種Klotho腺相關病毒作為制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物的新用途。本專利技術目的是這樣實現的=Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。動物實驗I.材料I. I實驗動物10周齡雄性SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物公司，10周齡雄性SD大鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。I. 2 試劑多克隆兔來源IGF-I、IGF-1R、p-Akt (Ser473)、t-Akt—抗購自北京博奧森生物公司；IGF-U Rat Insulin ELISA kit為R&D公司分裝產品；RIPA蛋白裂解液(漿)、PMSF、SDS-PAGE配膠試劑盒、轉膜液、電泳液、蛋白Maker、PVDF膜均為碧云天產品。2.方法2. I動物實驗方案實驗研究分4組，實驗組A、B、C 3組均為SHR大鼠，對照組(D組)為年齡、性別一致的SD大鼠，每組5只。所有大鼠均在重慶醫科大學附屬第一醫院中心實驗室動物房SPF級飼養，標準大鼠飼料喂養，飲水中加復合維生素B。自由取食飲水。采用無創尾動脈袖帶法測量大鼠靜息收縮壓。無創尾動脈袖帶法是一種常用的血壓檢測方法。所有大鼠在實驗前檢測血壓、體重。實驗組即A、B、C組SHR大鼠分別行尾靜脈注射PBS(0. 5ml/只)、rAAV. mKL (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml)和 rAAV. EGFP (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml);對照組 SD 大鼠尾靜脈注射PBS 0.5ml作為對照研究。隨后每兩周測體重、血壓一次，連續觀察12周。實驗結束時處死全部大鼠。處死前用水合氯醛腹腔注射麻醉，采血分離血漿。分離心臟，去除血液、大血管稱重。取部分左心室用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片做HE、MaSSon染色；部分OCT包埋，做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察熒光。2. 2免疫組化檢測心臟klotho蛋白表達使用博奧森SP免疫組化染色試劑盒，步驟如下大鼠心臟組織切片脫蠟至水，1%胰酶37°C 25min抗原修復，3 %過氧化氫孵育lOmin，封閉液37°C封閉25min，4°C孵育一抗 (Anti-Klotho,l 50)過夜，I 100 二抗37°C孵育30min，HRP標記鏈霉卵白素工作液孵育30min，DAB顯色l-5min。復染、脫水、透明、封片、晾干。Leica正置顯微鏡觀察、采圖，Image-Pro Plus 6. O 軟件分析陽性異染顆粒 IOD (Integrated Optical Density)值。2. 3 心臟 HE 及 Masson 染色各組大鼠心臟組織切片，常規HEQiematoxylin)染色觀察心肌細胞，同時進行Masson三色法膠原纖維染色，Leica正置顯微鏡觀察并采圖。2. 4RT-PCR法檢測心臟小鼠Klotho mRNA表達用RNAiso Plus按說明書提取心臟總RNA，Nanodrop2000微量分光光度計檢測總RNA濃度計A260/A280比值。總RNA濃度在3-5 μ g/μ L，Α260/Α280比值在I. 8-2. O之間，無明顯降解及蛋白污染，滿足逆轉錄需要。取I μ g總RNA,用PrimeScriptRT reagent Kit按說明書20 μ L體系逆轉錄，逆轉錄所得cDNA-20°C保存。根據NCBI GenBank收錄mRNA蛋白編碼區序列設計引物。小鼠Klotho (NCBI Reference Sequence NM_013823. 2):上游5，-GGG TCA CTG GGTCAA TCT-3，;下游 5’ -GCA AAG TAG CCA CAA AGG-3，，PCR 產物長度為 710bp。取 2μ L逆轉錄所得 cDNA，用 Premix Taq Version 2. OPCR 擴增小鼠 Klotho 基因。小鼠Klotho PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析。β-actin PCR產物長度為157bp。2.5GFP蛋白檢測新鮮心臟組織用OCT包埋，冰凍切片(20 μ m)。用Leica DM6000熒光正置顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，并采圖。2. OTestern blot 檢測 Klotho 蛋白表達取新鮮心臟組織約lOOmg，盡量剪碎，加400 μ L RIPA蛋白裂解液(含4 μ L ImMPMSF)冰上充分裂解30min，14，000g 4°C離心5min。收集上清，取IyL BCA法測蛋白濃度。另取20(^1^加同體積蛋白上樣緩沖液，沸水煮511^11，-201保存備用。配制8% SDS-PAGE分離膠，每孔加總蛋白40 μ g，蛋白電泳分離，根據蛋白Maker切膠，轉至PVDF膜。在含5 % BSA的TBST中37°C封閉lh。I : 750稀釋的Klotho—抗4°C孵育過夜。GAPDH—抗I : 1000稀釋后孵育。次日HRP標記二抗(I 3000) 37°C孵育Ihour。加ECL后X膠片曝光、顯影、定影。Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值。Klotho蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值為Klotho蛋白相對表達量。2. 7心臟體重指數大鼠處死前稱體重，處死后分離心臟，去除血液、大血管后稱重。心臟左心室體重指數=大鼠心臟左心室重量(g) XlOOO+大鼠體重(g)。2. 8數據分析所有數據應用PASW 18軟件分析。體重、血壓數據應用one-way ANOV A分析，其余數據應用two-ways ANOVA分析,其顯著性檢驗設置為95%可信區間，P < O. 05即為顯著性。3.結果3. IKlotho基因轉導對SHR大鼠血壓的影響在rAAV轉導前，17周齡的SHR大鼠基礎血壓明顯高于1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
Klotho腺相關病毒在制備治療SHR大鼠高血壓心臟病藥物中的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬厚勛，李寶善，王艷嬌，吳平，鄧明洪，羅玉梅，李運奎，周婷，楊秋晨，鄧小琴，
申請(專利權)人：重慶醫科大學附屬第一醫院，
類型：發明
國別省市：
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