本發明專利技術屬于醫學領域，特別涉及心力衰竭的診斷技術，具體為氨基末端腦鈉肽的B細胞表位肽段，氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：5所示，其制備的特異性抗體可用于作為心力衰竭的診斷試劑；本發明專利技術制備的氨基末端腦鈉肽是高純度的氨基末端腦鈉肽單體重組蛋白，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時可以作為建立氨基末端腦鈉肽定量檢測時的校準品。通過氨基末端腦鈉肽蛋白序列的B細胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測純度＞96％)、效價高(ELISA效價達1∶512000)、特異性好、可大批量制備等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫學領域，特別涉及心力衰竭的診斷技術。
技術介紹
心血管疾病是嚴重威脅人類生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure, HF)作為嚴重危害人類健康的心血管疾病中的一種病理綜合癥，已不再被簡單地看作是獨立臨床疾病，而是作為心血管疾病發展到后期的一個階段，即從始發危險因子(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病)到左心室肥大、心肌細胞功能紊亂、冠心病、最后發展成為心力衰竭。有學者統計，心力衰竭患者一旦出現典型癥狀，5年存活率男性為25%，女性為38%，與惡性腫瘤病人相仿。2003年，中國心血管健康多中心合作研究組應用四階段整群隨機抽樣方法，在中國10省市抽樣調查，結果顯示心衰患病率為O. 9%，隨著年齡增高，心衰患病率顯著上升。由于我國冠心病和高血壓發病仍呈上升趨勢，人口老齡化趨勢明顯， HF正成為我國心血管領域的重要公共衛生問題。在發達國家，約有7%的人群患有此病，目前也僅有2%的人被及時確診。心力衰竭是大多數心血管疾病的最終歸宿和最主要的死亡原因之一，呼吸困難是充血性心力衰竭(CHF)的主要癥狀，又是某些肺部疾病的主要臨床表現，相互間鑒別比較困難，而在急診工作中須在短時間內對呼吸困難做出正確診斷，因此，尋找一種敏感、快捷、準確的鑒別診斷方法對于急診科醫生來說是非常重要的，可以在很大程度上方便急診科醫生提高診斷的敏感性和特異性，并幫助判斷病情的嚴重程度。或者在尚未出現明顯“充血性”癥狀之前就著手干預治療，從根本上防治HF，延緩HF發展進程，提高患者的遠期存活率。從這個意義上來看，心力衰竭的早期診斷和治療監測非常重要。然而，無論是在住院病人還是門診病人，臨床上用常規方法不但對HF的診斷方面存在困難，而且在分析治療的結果時也不確定。如傳統的心電圖、超聲心動圖等檢查方式，特異性和及時性都不夠，而且傳統的檢查方式均不能對心肌損傷的長期影響進行評估，難以及時方便地指導患者的治療。1988年日本學者Sudoh T等從豬腦內首次分離出一種與心房鈉尿肽(Atrialnatriuretic peptide, ANP)功能相似的物質，即具有擴張血管、拮抗腎素-血管緊張素-醛固醇系統、抑制交感神經活性和促進尿鈉排泄作用，雖然這一物質與ANP的分子結構相似，但其氨基酸組成和組織學分布存在差異，故將其命名為腦鈉尿肽(Brain natriureticpeptide, BNP) 0目前，大量的研究已明確BNP是從其氨基酸前體蛋白(ρι·0-ΒΝΡ)中的羧基端裂解而來，是由心室細胞合成并分泌進入血液的32個氨基酸多肽，裂解同時產生76個氨基酸的無生物學活性的氨基末端腦鈉肽(ΝΤ-ρι·οΒΝΡ)，二者來源相同并且等摩爾分泌。通過組織生理學研究發現，牽拉刺激、激素(如兒茶酚胺、血管緊張素、內皮素)分泌以及缺氧均能導致心肌細胞、心臟成纖維細胞分泌proBNP。從理論上講，無論是檢測BNP還是NT-proBNP,都可以反映體內心肌細胞受到的容量負荷和壓力負荷的大小，均能夠單獨地預示左心室(LV)舒張末期壓力增高的狀況，能應用于充血性心力衰竭等相關疾病的鑒別診斷、療效監測及預后評估。ΒΝΡ、ΝΤ-ρι·οΒΝΡ檢測與肌鈣蛋白、CK-MB和肌紅蛋白不同，后三者是由于心臟損傷而釋放的標志物，而血漿ΝΤ-ρι·οΒΝΡ水平在心臟功能代償階段即可明顯升高，有利于更早發現心功能的異常。研究發現，BNP具有分子內的二硫鍵并且作為一種分析物不很穩定，其原因是由于BNP作為激素發揮生理功能，因而必須被迅速分解滅活。因此，它作為一種診斷標記的應用僅僅是有限的。而且BNP在血漿中含量較低，僅為7ng/L，而NT-pix)BNP的血漿含量平均值為41ng/L，后者對于區分健康個體和患有心力衰竭的患者，以及根據心力衰竭的嚴重程度對患者樣本進行分級所需要的檢測低限是足夠的，可保證自動化實驗室的樣品常規測試得以實施。另外，NT-proBNP在血漿中的半衰期為120分鐘，BNP的半衰期為22分鐘，提示NT-proBNP更易進行免疫定量分析。目前認為，NT-proBNP成為檢測HF的標準主要體現在以下幾個方面①診斷癥狀性心力衰竭，用于急性呼吸困難的鑒別診斷；②診斷無癥狀性左室功能障礙，早期發現心衰病人判斷心衰病人的危險分層，以判斷是該入院還是出院檢驗心力衰竭的治療·評估心力衰竭病人的預后評估急性冠脈綜合征(ACS);⑦篩選慢性心衰高危人群；⑧作為猝死的標志物診斷舒張功能不全。羅氏診斷試劑公司(Roche Diagnostics, Inc)在美國和歐洲16個醫學中心對2000多位健康和病患男女進行的臨床研究，此項研究顯示充血性心力衰竭癥狀的嚴重性與NT-proBNP的水平有關。2002年，國際上已經公認NT-proBNP是測定心衰的一個劃時代的具有特異性的標志物。早期實驗的研究對象多是急診室呼吸困難、肺心病、心臟病患者，顯示ΝΤ-ρι·οΒΝΡ與心衰具有很好的相關性，陽性預測值達到90% -95%，其陰性預測能力更具有價值。當急性心力衰竭出現左室充盈壓增加的臨床綜合征以及如缺血、肺栓塞等任何導致肌細胞伸展的情形，檢測ΝΤ-ρι·οΒΝΡ非常有益，同時對于鑒別呼吸困難是否為心源性原因具有重要意義，優于臨床判斷。另外，ΝΤ-ρι·οΒΝΡ還能輔助判斷進展期心衰患者的預后，以及對左心室功能不全的治療進行監測和指導。目前，基于NT-proBNP的心力衰竭試劑盒，僅有羅氏公司持有。靈敏度更高或成本更低的相關試劑盒急需開發。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供氨基末端腦鈉肽B細胞表位肽段，其能作為氨基末端腦鈉肽單克隆抗體的抗原。為實現上述技術目的，本專利技術的技術方案為氨基末端腦鈉肽B細胞表位肽段，所述氨基末端腦鈉肽B細胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示。上述氨基酸序列是通過如下手段獲取的從NCBI Protein數據庫中獲取如SEQ ID NO :5所示的氨基末端腦鈉肽蛋白序列；分別對氨基末端腦鈉肽的蛋白的二級結構、抗原性、親疏水性、可及性、柔韌性以及可能的糖基化位點，對各區段進行分析評分，選取得分高的區域作為B細胞表位區域，其序列如SEQ ID NO4 或 SEQ ID N0:5 所示。所述的B細胞表位肽段化學合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其與BSA的交聯能力，接著與BSA或KLH交聯。將所述的B細胞表位肽段與載體蛋白BSA或KLH交聯之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強免疫性。本專利技術的目的之二在于提供一種雜交瘤細胞，其能特異性的分泌氨基末端腦鈉肽的單克隆抗體。為實現上述目的，本專利技術的技術方案為所述的氨基末端腦鈉肽的B細胞表位肽段制備的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞的制備是通過所述氨基末端腦鈉肽的B細胞表位肽段與BSA或KLH交聯后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾細胞懸液并制備SP2/0細胞懸液(脾臟B淋巴細胞)，并與骨髓瘤細胞和融合，將融合細胞選擇性培養，通過ELISA篩選后得到的雜交瘤細胞。將篩選出的最強陽性細胞進行克隆化培養，同時在克隆化培養的雜交瘤細胞中篩選出最強陽性化的雜交瘤細胞送于并送中國典型培養物保藏中心 (武漢大學保藏中心)保藏，保藏號為CCTCC NO C201288,其可穩定分泌所述單本文檔來自技高網...
【技術保護點】
氨基末端腦鈉肽的B細胞表位肽段，其特征在于：所述氨基末端腦鈉肽的B細胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：4或SEQ？ID？NO：5所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃洪濤，石延賓，姚靜，張憲，胡偉，魏勇，
申請(專利權)人：重慶業為基生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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