本發明專利技術涉及一種重組CCR5Δ32/Δ32基因型胚胎干細胞株，本發明專利技術還涉及所述干細胞株的制備方法。本發明專利技術利用同源重組技術直接對人胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立了具有永生性的CCR5Δ32/Δ32基因型靈長類動物胚胎干細胞株。所得到的細胞株在被定向誘導分化為CD4陽性細胞后，既能抵御病毒的侵入，又保留了CCR5的其它功能，為治療艾滋病提供了一種新途徑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種重組CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株，本專利技術還涉及采用同源基因重組技術獲得所述干細胞株的方法。
技術介紹
CCR5是T細胞表面與艾滋病毒結合的聯合受體之一，研究人員們一直在尋找改變或破壞CCR5受體功能的方法，希望達到治療艾滋病的目的。有人利用鋅指核酸酶破壞造血干細胞的 CCR5 基因表達(Nathalia Holt et al. Human hematopoietic stem/progenitorcells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5control HIV-Iin vivo.Nat Biotechnology28(8) :839_47，2010.)，使CCR5基因發生突變。但此方法的缺點是造成T細胞的CCR5基因完全失活狀態，不能保留CCR5的其它功能。而且，這種CCR5基因失活的細胞不具備永生性。 已發現CCR5A32/A32基因型的人群對艾滋病具有天然的免疫力。文獻(Hutter, G. etal. Long-term control of HIV by CCR5Delta32/Delta32stem celltransplantation. N Engl JMed 360 :692-698,2009)報道用帶有天然缺失 32 堿基的 CCR5基因的骨髓成功治愈了一例既有白血病又有艾滋病的患者。CCR5A32是指該基因缺失32個堿基的突變型，由于此突變導致艾滋病毒無法與T細胞結合從而無法攻擊T細胞產生免疫缺陷。遺憾的是，盡管自然界本身存在這種基因型，真正處于純合狀態(CCR5 Λ 32/Λ 32)的這種基因型并對艾滋病具有天然免疫力的個體極少，在歐洲人群中僅占I %，而在亞洲和其他人種至今未見報道。因此，想要利用他們的骨髓或臍帶血來治療艾滋病基本不具備可能性和實用性。況且，不論是骨髓或是臍帶血，都無法在體外擴增，更是增加了其獨有的稀缺性。而人為定點刪除CCR5中32個堿基的CCR5 Δ 32/ Δ 32的并具有永生性的細胞株，至今尚未見報道。大腸桿菌同源重組是20世紀90年代末發展起來的一種新的基因工程技術，最初是在大腸桿菌Escherichia coli里進行的,它可以不必依賴限制性酶切位點而定點精確地完成諸如片段插入、刪除及序列改變等等基因改造。大腸桿菌同源重組技術常用于染色體DNA的靶向修飾-基因敲入與敲除，以及空隙修復(gap-r印air)方式獲取目的基因。二者共同之處是都必須以PCR方法合成兩側50-70bp的短同源序列，然后通過細菌內同源重組將短同源序列間的片段插入基因的目標位置或套取相應的基因目標片段。由此可見，利用該項技術可以在大腸桿菌體內方便地進行DNA靶序列的敲除、敲入、克隆、突變等多種遺傳工程操作。結合目前飛速發展的胚胎干細胞(ES)技術使得在生物整體水平上定向改變和修飾哺乳類動物的遺傳物質稱為可能。雖然基因打靶技術應用于改造胚胎干細胞基因較早，但由于以前打靶載體多為利用限制性酶切技術構建打靶載體，由于酶切位點的局限性打靶載體的同源臂長度受到限制，從而使得胚胎干細胞的基因同源重組成功率極低。而最近利用細菌內同源重組技術在BACDNA的基礎上可以構建出足夠長的同源臂的打靶載體，因此可以較大地提高胚胎干細胞基因打革巴的效率(Song et al. Modeling disease in human ESCs using an efficientBAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell,6 :80-89,2010)。綜上，如果能利用同源基因重組技術手段，定點刪除CCR5的32個堿基，得到CCR5 Δ 32，建立一種處于純和狀態CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型的永生性細胞株。這種永生性細胞株，在適當的條件下，可以定向分化為所需要的細胞(如CD4陽性細胞)，既能抵御特定病毒的侵入，同時又保留了 CCR5的其它功能。并且，這種過程可以無限重復。因此，建立永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株具有重大意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是對胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立 具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型靈長目動物胚胎干細胞株。所得到的細胞株在被定向誘導分化為CD4陽性細胞后，既能抵御特定病毒的侵入，又保留了 CCR5的其它功能，且具有永生性。本專利技術的另一目的是利用同源重組技術制備上述細胞株。本專利技術對人胚胎干細胞的CCR5基因的32個堿基進行定點刪除改造，建立了具有永生性的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株，達到了上述專利技術目的。因此，本專利技術提供了一種其CCR5基因特定位點缺失了 32對堿基；所述特定位點是 3321-3352，S卩 TATCAATTCTGGAAGAAITTCCAGACATTAAA (CCR5 基因號 NG 012637. 1，位于3ρ21· 31)。本專利技術在基因打靶hES的過程中確認CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型(見實施例)。本專利技術根據多項人胚胎干細胞株常用鑒定實驗(多能基因的表達、擬胚體形成、畸胎瘤形成及核型分析)證明經過基因改造后的人胚胎干細胞株仍然保留了人胚胎干細胞的特征活性，即，該細胞株具有分化成CD4陽性T細胞的能力。T細胞表面標志為CD3陽性，為HIV病毒侵襲感染的T細胞亞型為⑶4陽性。如果CCR5 Λ 32/ Λ 32基因型hES細胞株在體外誘導分化成CD4陽性T細胞，可以通過抗CD3、CD4抗體進行免疫組化實驗和流式細胞術鑒定，當實驗結果表明分化細胞為CD3、CD4雙陽性時即證明該細胞株具有分化成CD4陽性T細胞的能力。本專利技術所得到的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干細胞株，經定向分化為骨髓造血干細胞(或CD4陽性細胞)后，即可作為細胞性藥物，直接用于HIV病毒的基因治療。由于人胚胎干細胞具有全能性，可以在體外特定條件下分化成人體各種組織細胞包括CD4陽性T細胞；同時人胚胎干細胞具有干細胞特性，可以在體外無限增殖擴增。因此，本專利技術所獲得的CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型人胚胎干細胞株是一種特殊的人胚胎干細胞株，既能無限擴增殖，又具有多向分化潛能。將其定向分化為骨髓干細胞(或CD4陽性細胞)時，可用于艾滋病的治療。由于CCR5參與了機體的免疫功能，當發生Λ 32突變時，僅導致病毒不能侵入，而對其它功能基本不受影響，而且由于胚胎干細胞的永生性和無限擴增能力，使得這種過程得以無限重復，具有很強的實用性，為治療艾滋病提供了一種新途徑。另一方面，本專利技術還提供了一種采用同源重組技術獲得CCR5 Δ 32/ Δ 32基因型胚胎干細胞株的方法。本方法的主要技術手段是采用BAC DAN和大腸桿菌內同源重組技術構建打靶載體，電轉入胚胎干細胞后改造CCR5基因。具體方法是采用BAC DAN和大腸桿菌內同源重組技 術構建打靶載體，電轉化胚胎干細胞后改造CCR5基因。所述構建打靶載體是構建兩個帶有正負篩選PNS標記的中間打靶載體和一個無篩選標志的CCR5A32打靶載體，通過標記和置換兩步打靶法獲得一本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種靈長目動物的CCR5Δ32/Δ32基因型細胞株，其特征是CCR5基因位于3321～3352位點的32對堿基缺失。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李東升，曾毅，盧智勇，滕智平，
申請(專利權)人：武漢丹彌優生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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