一種快速高效檢測(cè)亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種快速高效檢測(cè)亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法。采用的技術(shù)方案是：1）設(shè)計(jì)一對(duì)外部引物A1和A2，一對(duì)內(nèi)部引物B1和B2；2）PCR擴(kuò)增：包括兩輪PCR過(guò)程，第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為A1和A2，或A1和B2，或B1和A2；第二輪PCR的擴(kuò)增為普通PCR，所用引物為B1和B2，模板為第一輪PCR產(chǎn)物1-2ul，所用酶為ExTaq或普通rTaq；3）擴(kuò)增產(chǎn)物小于700bp。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、實(shí)驗(yàn)成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、檢測(cè)快速易掌握且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性好、在實(shí)驗(yàn)室中易完成的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用到人類(lèi)、哺乳動(dòng)物以及植物基因組特定基因的甲基化修飾檢測(cè)中。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及表觀遺傳學(xué)修飾中DNA甲基化修飾方式的檢測(cè)手段。
技術(shù)介紹
DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組最常見(jiàn)的一種DNA共價(jià)修飾形式，是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要方面。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥(niǎo)嘌呤(7_mG)。真核生物中，DNA甲基化主要是以5-甲基胞嘧啶的形式存在。由于DNA甲基化特別是胞嘧啶甲基化在真核生物基因組中十分普遍，故受到生命科學(xué)界的極大關(guān)注。大量研究表明，DNA甲基化參與了高等生物的多種細(xì)胞活動(dòng)。這其中主要包括組織特異性基因的表達(dá)，異染色質(zhì)的形成，發(fā)育機(jī)制，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn) 座激活，X染色體的失活，基因組印記和腫瘤基因的形成等。DNA甲基化還能引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)互作方式的改變，從而控制基因表達(dá)。因此，對(duì)于真核生物(特別是人類(lèi)和植物)的甲基化修飾作用與基因“時(shí)”，“空”表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系；是分子生物學(xué)中非常熱點(diǎn)的研究之一。然而如何利用快速簡(jiǎn)易的方法檢測(cè)出甲基化的修飾位點(diǎn)是一棘手問(wèn)題，目前應(yīng)用的比較廣泛的方法是亞硫酸鹽測(cè)序法(bisulfite sequencing),該方法理論上可以檢測(cè)出DNA序列中所有胞嘧啶的甲基化情況，該方法主要包括三個(gè)步驟亞硫酸鹽處理，PCR擴(kuò)增目的片段，測(cè)序。雖然亞硫酸鹽處理和后續(xù)的測(cè)序技術(shù)均已有成型技術(shù)(亞硫酸鹽處理已有試劑盒商品，測(cè)序技術(shù)有測(cè)序公司)，但是PCR擴(kuò)增目的片段的擴(kuò)增是需要研究者自己操作完成的，因此在這一步驟中尚存在的問(wèn)題是 (1)由于亞硫酸鹽處理后DNA序列會(huì)發(fā)生改變，且形成的胸腺嘧啶T容易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，一般的退火溫度無(wú)法完全打開(kāi)雙鏈，為PCR擴(kuò)增帶來(lái)困難，需要設(shè)計(jì)很多備選引物，靠多次嘗試的方法來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增； (2)若提高引物退火溫度，則由于亞硫酸鹽處理后，基因組DNA已被打斷成SOObp左右的片段，因此用常規(guī)方法設(shè)計(jì)引物，不容易擴(kuò)增或者不能擴(kuò)增； (3)用高保真的Taq酶(金牌rTaq、LATaq,ExTaq等)擴(kuò)增效果沒(méi)有改善，且成功率低、成本高； (4)需要對(duì)具有甲基化的和非甲基化的位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)引物，比較繁瑣復(fù)雜。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種快速高效檢測(cè)亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用的技術(shù)方案是一種快速高效檢測(cè)亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法，包括如下步驟首先，設(shè)計(jì)一對(duì)外部引物Al和A2，一對(duì)內(nèi)部引物BI和B2 ;其設(shè)計(jì)方法如下 1)根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)引物； 2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續(xù)3次以上重復(fù)； 3)正向引物末端不能為C; 4)正向引物少于5個(gè)C，反向引物少于5個(gè)G; 5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ； 6)根據(jù)上述原則設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，包括一對(duì)根據(jù)目的片段和/或其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的外部引物(Al和A2)和一對(duì)在外部引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)的內(nèi)部引物(BI和B2)。通常情況下， Al，BI作為正向引物，A2，B2作為反向引物。其次，PCR擴(kuò)增，它包括兩輪PCR過(guò)程， 第一輪PCR的擴(kuò)增參數(shù) 1)一輪擴(kuò)增參數(shù)95°C或 94°C 45S 或 30S，62°C 45S 或 30S，72°C 60S ； 2)以后每輪退火溫度遞減1°C，擴(kuò)增9輪；或退火溫度遞減O.7°C，擴(kuò)增11輪； 3)然后按下列參數(shù)擴(kuò)增25輪95°C或94°C45S或30S，52°C 45S或30S，72°C 60S ； 4)第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為Al和A2，或Al和B2，或BI和A2； 第二輪PCR的擴(kuò)增參數(shù) 1)按照下列參數(shù)擴(kuò)增35 輪95°C或 94°C 45S 或 30S，58°C 45S 或 30S，72°C 60S ； 2)普通PCR，所用引物為BI和B2，模板為第一輪PCR產(chǎn)物l_2ul，所用酶為ExTaq或普通 rTaq ； 三)擴(kuò)增產(chǎn)物小于700bp。本專(zhuān)利技術(shù)所涉及的引物設(shè)計(jì)思路和PCR技術(shù)是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)得來(lái)，適用于所有亞硫酸鹽測(cè)序的材料，不分物種，特別適用于植物材料。上述的方法應(yīng)用于檢測(cè)動(dòng)植物基因組DNA甲基化修飾位點(diǎn)。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果是本專(zhuān)利技術(shù)將兩種PCR程序結(jié)合在一起解決了以下問(wèn)題 (1)降低了亞硫酸鹽測(cè)序的成本并提高了實(shí)驗(yàn)效率，本專(zhuān)利技術(shù)只需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用ExTaq或普通rTaq，使用2ul亞硫酸鹽處理后的模板DNA便可一次性擴(kuò)增出目的片段，進(jìn)而連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，挑菌測(cè)序； (2)提高擴(kuò)增效率，本專(zhuān)利技術(shù)設(shè)計(jì)兼并引物，只通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)即可把甲基化和未甲基化位點(diǎn)共同擴(kuò)增出來(lái)； (3)解決了DNA模板因處理后序列改變而引起的常規(guī)PCR引物擴(kuò)增不出和PCR擴(kuò)增困難的問(wèn)題。增加引物的長(zhǎng)度，并且利用兩對(duì)引物之間的聯(lián)合擴(kuò)增來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題； (4)采用先降落PCR再普通PCR的方法，解決了普通PCR程序不容易擴(kuò)增或者不能擴(kuò)增的問(wèn)題；并且擴(kuò)大了引物的組合范圍，比如在降落PCR循環(huán)中，既可以使用A1/A2組合，也可以使用A1/B2組合，也可以使用B1/A2組合，只要有清晰的目的片段擴(kuò)出來(lái)，即可再用這一輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪的普通PCR擴(kuò)增(引物均為B1/B2組合)，使用方便， (5 )本專(zhuān)利技術(shù)適用于所有的高等生物，特別是人類(lèi)和植物。總之，本專(zhuān)利技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、實(shí)驗(yàn)成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、檢測(cè)快速易掌握且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性好、在實(shí)驗(yàn)室中易完成的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用到人類(lèi)(特別是原癌基因和抑癌基因)、哺乳動(dòng)物以及植物基因組特定基因的甲基化修飾檢測(cè)中。附圖說(shuō)明圖I是實(shí)施例I中同一模板經(jīng)過(guò)不同的PCR程序擴(kuò)增后結(jié)果； M =IOObpmarker ;1_3使用普通PCR程序，退火溫度分別為60°C，55°C和52°C的擴(kuò)增結(jié)果；4-6應(yīng)用本專(zhuān)利申請(qǐng)的“第I輪PCR擴(kuò)增”程序的擴(kuò)增結(jié)果，每道表示一次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),共三次獨(dú)立的重復(fù)。圖2是實(shí)施例I中第II輪擴(kuò)增后結(jié)果；如圖所示為兩次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。圖3是實(shí)施例I中亞硫酸鹽測(cè)序分析結(jié)果展示。圖4是實(shí)施例2-4的PCR擴(kuò)增結(jié)果；M: marker ;A_F 擴(kuò)增產(chǎn)物大小依次為446bp，332bp，493bp，425bp，493bp，402bp。圖5是實(shí)施例2-4中亞硫酸鹽測(cè)序分析結(jié)果展示。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 檢測(cè)亞硫酸鹽處理后的水稻基因組中位于10號(hào)染色體上的反轉(zhuǎn)座子Tosl7的左側(cè)LTR的DNA甲基化修飾的PCR方法 一)設(shè)計(jì)內(nèi)部外部引物 1)根據(jù)Tosl7在Genebank上的克隆號(hào)AC087545在NCBI網(wǎng)站上下載到Tosl7序列，其左側(cè)LTR序列為138bp，再通過(guò)NCBI網(wǎng)站下載出左側(cè)LTR序列上下游各600bp的序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件pimer5按照如下方法設(shè)計(jì)引物； 2)引物大小為28-35nt，要避免A，T各連續(xù)3次以上重復(fù)； 3)正向引物末端不能為C; 4)正向引物少于5個(gè)C，反向引物少于5個(gè)G; 5)正向引物中的C用兼并堿基Y代替C/T;反向引物中的G用兼并堿基R代替G/A ； 6)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，包括一對(duì)根據(jù)目的片段和/或其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種快速高效檢測(cè)亞硫酸鹽處理后DNA甲基化修飾的PCR方法，其特征在于包括如下步驟：一）設(shè)計(jì)一對(duì)外部引物A1和A2，一對(duì)內(nèi)部引物B1和B2；二）PCR擴(kuò)增：包括兩輪PCR過(guò)程，第一輪PCR的擴(kuò)增參數(shù)：1）一輪擴(kuò)增參數(shù)：95℃或94℃？？45S或30S，62℃？？45S或30S，72℃？？60S；2）以后每輪退火溫度遞減1℃，擴(kuò)增9輪；或退火溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增11輪；3）然后按下列參數(shù)擴(kuò)增25輪：95℃或94℃？？45S或30S，52℃？45S或30S，72℃？？60S；4）第一輪PCR為降落式PCR，所用引物為A1和A2，或A1和B2，或B1和A2；？第二輪PCR的擴(kuò)增參數(shù)1）按照下列參數(shù)擴(kuò)增35輪：95℃或94℃？？45S或30S，？58℃？？45S或30S，72℃？？60S；2）普通PCR，所用引物為B1和B2，模板為第一輪PCR產(chǎn)物1？2ul，所用酶為ExTaq或普通rTaq；三）擴(kuò)增產(chǎn)物小于700bp。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王紅艷，王秋雨，韓陽(yáng)，周嬋，王錚，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：遼寧大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：