植入前遺傳篩查用的比較性基因組雜交陣列方法技術

提供了測試樣品基因組DNA中存在拷貝數不均衡的確定方法。所述方法可以分別測量單一測試樣品與第一雜交陣列的雜交和多個參照樣品與多個其他各自測試陣列的雜交。基于最佳擬合參照陣列，可以相對于待測陣列來確定拷貝數。所述最佳擬合可以在最接近或最相似的測得信號信噪比的基礎上予以確定。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求2010年3月16日提交的美國專利申請12/724，865的權益，其全部內容通過引用并入本文。領域本專利技術涉及用于檢測胚胎、卵母細胞、極體或相關活檢物的細胞內遺傳異常的方法。背景在IVF (體外受精)領域中，希望在胚胎植入前鑒定胚胎細胞中的染色體數量和染 色體組。越來越多的證據表明影響胚胎存活率的最重要因素之一是染色體不均衡，包括拷貝數增加/損失和整個染色體的非整倍體(染色體數目異常)。當前的測試方法首先涉及代表被測試胚胎的遺傳物質的分離。非整倍體分析中目前使用的樣本是與卵母細胞相關的極體切片、來自卵裂球切片(與第3天胚胎相關)的單細胞、或囊胚滋養層細胞切片(與第5天胚胎或囊胚相關)。但在某些情況下，在過程中的其他點或多個點采集的樣品經證明更有效。然后通過多種方法對極體或細胞進行測試來檢測拷貝數的不均衡。雖然文獻中經常見到的術語是PGD，但考慮到本申請的目的，還是把這類測試方法簡稱為胚胎植入前遺傳篩查(PGS)。名詞PGS還應當包括測試極體來評估卵母細胞的質量從而例如保證信息可靠的卵子庫服務。比較基因組雜交(CGH)技術已被用于檢測基因組DNA中是否存在被擴增或刪除的序列(對應所謂拷貝數的變化)以及它們的位置。一般來說，基因組DNA分離自正常的參照細胞，也分離自測試細胞。將兩個核酸樣品差異標記，然后與參照細胞的中期染色體原位雜交。參照和測試DNA中的重復序列被去除，或者通過某些手段降低它們的雜交能力。通過檢測來自兩個DNA的信號比率改變的區域，可以識別測試細胞中拷貝數增加或減少的染色體區域。這類拷貝數變化的區域的檢測對診斷遺傳疾病尤其重要。如以上描述的中期CGH已被采用并且有能力篩查所有染色體中的異常。為了將CGH分析應用到PGS環境，需要在分析前將整個基因組擴增從而使DNA的量從單個細胞(5_10 8)增加到適合中期06!1(14 8)的水平。常用的擴增方法包括DOP-PCR (Teleniuset al，1992)，或者更近期的全基因組擴增試劑盒，比如GENOMEPLEX (Rubicon genomics)和REPLI-G(Qiagen)。臨床情景中使用細胞分裂中期CGH的主要問題是它可能需要大約4天來完成，在不進行后續周期中的胚胎冷凍和植入的情況下，這與IVF中胚胎植入前所需的時間框架不相容。此外，該方法技術上頗有挑戰性，需要較高的專業水平來實施和分析。這些困難限制了中期CGH在PGS中的廣泛使用。Pinkel等人在1998和2003年公開了已廣為人知的陣列比較基因組雜交的技術，以下簡稱為arrayCGH。1998年，Solinas-Toldo等人描述了類似的“基于矩陣的比較基因組雜交”方法。arrayCGH技術就利用雙鏈DNA的結合特異性方面來說，與CGH依賴于相似的分析原理。在arrayCGH中，參照細胞的中期染色體被可能數以千計的固體支持物結合的未標記靶核酸(探針)集合所取代，例如，已經被置入染色體特定位置的克隆的陣列。因此ArrayCGH是一類高通量檢測兩個DNA樣本之間拷貝數差異的比較技術，其中所述兩個DNA樣品與相同的雜交區域雜交。它比CGH具有的優勢是它能達到更高的分辨率，并且在拷貝數檢測很重要的其他領域之外，還能夠應用于由拷貝數變化所誘發的遺傳性疾病的檢測和診斷。雖然細節有所不同，可以使用多種不同的探針類型，包括在寡核苷酸、PAC和細菌人工染色體(BAC)陣列中遇到的探針類型。ArrayCGH目前被用于在體質細胞遺傳學中協助臨床醫務人員研究基因組不均衡，并且越來越多地用于癌癥研究。這些應用有著令人難以置信的要求，要求為這些應用設計的微陣列的生產標準比那些用于學術或臨床前研究應用的微陣列的標準嚴格得多。ArrayCGH相對中期CGH所具有的優點在于解釋更簡單并且容易實現自動化；此外完整分析所需要的時間更短。ArrayCGH可用于檢測單個細胞中的非整倍體，并已成功地應用于PGS。對這項技術，必須將單細胞擴增，采用那些與中期CGH使用的方法相同的方法。 ArrayCGH允許在48小時內完成整個基因組的全面分析，這使得在不需要PGS中細胞凍存的情況下進行非整倍體篩查。為了達到最佳的分析結果，arrayCGH需要測試樣品和參照樣品在質量和濃度方面很好地匹配。在PGS的情形中，任何分析的起點對卵子庫來說都是代表受精胚胎或卵母細胞的遺傳物質。目前，有可能檢驗極體或卵裂球內所含的遺傳物質、由8細胞胚胎提取的單個細胞，或者替代的來自胚泡或相關活檢物的少量細胞。由于從這類材料中只能獲得有限量的DNA，多數下游分析需要利用DNA擴增程序來產生眾多拷貝數量的原料。應當明白，當受精過程開始時，有兩種極體(PBl和PB2)被排出。這個過程并非這么簡單。本文中，名詞“極體”可包括排出的或者由初級或次級卵母細胞切片的極體。雖然可以使用未擴增的基因組參照材料，相應的arrayCGH結果可能顯示出由于擴增測試與未擴增參照的匹配度不好造成的高噪音水平。因此，這種情形中使用的參照材料往往是“正常”的DNA樣品集合稀釋到包含大致類似量的DNA作為少數單個細胞。然后使用相同的方法將這種稀釋的參照材料和試驗樣品一樣進行擴增。即使采取了這些步驟來配合測試和參照樣本的性質，這并不總是有效，結果的明確性可能有不同。這可能是多種原因造成的，包括在起始DNA的定量中的小誤差和因此造成的稀釋樣品中的DNA量的變化；擴增過程的隨機性質造成的變化；參照中不存在的測試樣品中的雜質的擴增；低樣品DNA “質量”導致的增加的非特異性擴增；樣品提取和保存中使用的試劑的用量和類型的不同。在所有情況中，擴增樣品和參照所產生的差異都可能改變和模糊真實的擴增結果，導致arrayCGH特性改變，并且往往會增加噪音和抑制動態范圍。PGS是一種診斷應用，每個實驗的標準做法是包括一個內部對照以證明實驗成功運作，并且能夠對各個實驗之間由于例如前面描述過的擴增問題產生的動態范圍的變化進行評估。使用arrayCGH時，解決這一問題最常用的方法是使用一個相對于測試樣品拷貝數增加/減少已知的參照樣品。然后，可以用這些來衡量每個單獨檢測的表現。參照樣品常常與測試樣品的性別不匹配，使得對于X和Y染色體測試相對參照樣品的log2比率發生位移，因此動態范圍的測量值也發生位移。雖然適用許多情況，但是對于PGS的情況，一般不可能預先知道樣品的性別，特別是對于卵裂球或囊胚切片樣品的非整倍體篩查，可以是任一性別。因此，使用一個單一參照作為內部對照不可能可靠。此外，給測試樣品選擇單個適當的參照，并且參照在性染色體以外的區域的拷貝數不均衡是已知的一般是不可能的，因為胚胎/卵母細胞中的拷貝數變化程度非常高，目前的研究表明沒有區域是可預見的穩定的。在一些實施方案中，可以根據非整倍體狀態選擇用于植入的胚胎。在其它實施方案中，基于較小的遺傳畸變進行選擇。替代的方法是使用包含非人類對照序列的參照。然而，這種方法不理想，因為很難選擇能夠準確模仿人類序列的行為的非人類序列。無論如何，使用非人類對照序列還是會遭受相同的擴增偏向性和其他偏向性，作為單一參照這樣的選擇有挑戰性。為了克服PGS的這一問題，有必要進行兩次分析單一測試樣品的常規arrayCGH雜交，一次相對男本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A克雷格，A布朗，N哈恩，
申請(專利權)人：藍色地精有限責任公司，
類型：
國別省市：