本發(fā)明專利技術公開了一種花燭胚性細胞快速增殖并再生植株的方法。本發(fā)明專利技術通過改變現有技術中懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分、光照條件和繼代間隔，使胚性細胞團每周可增殖2.82~3.02倍，每月增殖最高可達83倍，比以往技術的增殖效率提高了15倍以上，而且簡化了植株再生的操作過程，只需要一個步驟即可完成胚性細胞團的植株再生；同時縮短了植株再生的時間，6~10周完成植株再生，比以往技術節(jié)約時間20天以上。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物誘導再生
，具體涉及。
技術介紹
花燭iAnthurium aflt/raea/w )又名紅掌、安祖花,為天南星科花燭屬植物,是一種重要的熱帶觀賞植物。在許多熱帶國家和地區(qū)花燭是主要的切花和盆花來源，已發(fā)展成為僅次于熱帶蘭的第二大熱帶花卉商品。目前，花燭種苗生產主要采用器官發(fā)生途徑，該途徑存在愈傷組織誘導周期較長、無菌苗易發(fā)生退化與變異等缺點，而體細胞胚胎發(fā)生途徑則具有體胚數量多、繁殖速度快、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點，與液體培養(yǎng)方式相結合可為花燭的規(guī)?；N苗生產提供有效途徑?！せT體細胞胚發(fā)生和植株再生研究始于20世紀90年代。1992年，Kuehnle等首次通過花燭葉片培養(yǎng)，高頻率誘導體細胞胚胎發(fā)生并獲得完整再生小植株；2006年，辛偉杰等由‘Sonate’品種葉片誘導出可以連續(xù)繼代增殖的胚性愈傷組織并獲得了再生植株；2011年,Fitch等以‘Marian Seefurth’品種葉片誘導獲得的胚性愈傷組織,進行遺傳轉化并獲得了轉基因植株；2008年，許傳營以‘Amigo’品種葉片誘導的胚性愈傷組織為材料進行了液體懸浮培養(yǎng)和植株再生研究，獲得的胚性細胞團每月可增殖4飛倍；經過分化培養(yǎng)再生出完整小植株。根據公開資料，現有技術中花燭胚性懸浮培養(yǎng)條件為l/2MS+2，4-D I. Omg/L+KT(TO. 5 mg/L+蔗糖3%，暗培養(yǎng)，繼代間隔為25天。胚性細胞懸浮培養(yǎng)系的增殖系數大約是每月4飛倍?；T胚性懸浮細胞團進行植株再生分為四個階段(1)將的胚性愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，形成盾形胚；(2)將盾形胚接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，體胚萌發(fā)產生白色透明狀胚根；(3)液體條件下進行光照培養(yǎng)20天，胚根變綠并伴有胚芽萌發(fā)；(4)將體胚轉接于固體培養(yǎng)基中進行萌發(fā)成苗，30天后萌發(fā)出真葉。整個植株再生過程需要100天。現有技術中胚性細胞懸浮培養(yǎng)系的增殖速度低，植株再生步驟復雜，周期較長。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中胚性細胞懸浮培養(yǎng)系的增殖速度低，植株再生步驟復雜，周期較長的不足，提供一種花燭胚性細胞快速增殖并再生植株的改良方法。本專利技術的目的通過以下技術方案予以實現 提供，包括以下步驟 (a)誘導形成胚性愈傷組織； (b)建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)系，獲得直徑I.(Γ2. O毫米的胚性細胞團； (C)利用步驟(b)獲得的胚性細胞團再生植株，其中所述建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)系包括如下步驟(bl)破碎所述胚性愈傷組織獲得直徑不超過I. O毫米的胚性細胞團； (b2)將O. 1 0. 2克的胚性細胞團接種于懸浮培養(yǎng)基中，在溫度25 27°C，光照800 1000lux,90^110轉/分鐘震蕩培養(yǎng)，其中所述懸浮培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每I升基本培養(yǎng)基中添加2. (Γ3. O毫克的6-ΒΑ、1. (Γ2. O毫克的2，4_D、2(T40克的蔗糖，pH值為5. 6 6. O ； (b3)6^8天繼代一次，繼代時將增殖的胚性細胞團破碎，將O. Γ0. 2克的胚性細胞團轉移至新鮮的懸浮培養(yǎng)基的中，按相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，3^4周后，胚性細胞大量增殖，獲得直徑為I. (Γ2. O毫米的胚性細胞團。在優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(a)包括 (al)取花燭的幼嫩苗葉片或莖段，經表面消毒處理，將葉片或莖段切成3 10毫 米的片段，接種于胚性誘導培養(yǎng)基中； (a2)在溫度25 27°C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3飛周，獲得黃色的胚性愈傷組織。在優(yōu)選的實施方式中，所述花燭的品種為阿拉巴馬。在優(yōu)選的實施方式中，所述繼代為7天一次。在優(yōu)選的實施方式中，所述步驟(C)包括 (Cl)將獲得的直徑I. (Tl. 5毫米的細胞團接種至分化培養(yǎng)基中； (c2)在溫度25 27°C、光照強度為1000 1400 lux，每日10 14小時光照環(huán)境中培養(yǎng)6^10周后，形成綠色體細胞胚并進一步發(fā)育形成完整小植株。在本專利技術的實施方式中，所述分化培養(yǎng)基以1/41/20MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每I升基本培養(yǎng)基添加(TO. 01毫克的6-BA、10克的蔗糖和6、克的瓊脂，pH值為5. 6^6. 0，在優(yōu)選的實施方式中，所述分化培養(yǎng)基以Ι/fl/lOMS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，更優(yōu)選為以1/10MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實施方式中，I升基本培養(yǎng)基中添加O. 005毫克的6-BA。本專利技術的有益效果是本專利技術通過改變懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分、光照條件和繼代間隔，胚性細胞團每周增殖最高可達3. 02倍，每月可增殖83倍，按每月增殖的倍數計算，比以往技術的增殖效率提高了 15倍以上；而且簡化了植株再生的操作過程，只需要一個步驟即可完成胚性細胞團的植株再生；同時縮短了植株再生的時間，6 10周完成植株再生，t匕以往技術節(jié)約時間20天以上。具體實施例方式下面結合實施例對本專利技術作進一步說明 實施例I (1)胚性愈傷組織胚性誘導取花燭品種阿拉巴馬的幼嫩苗葉片，經表面消毒處理，將葉片切成5毫米的片段，接種于胚性愈傷組織胚性誘導培養(yǎng)基中，在溫度26°C的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)4周，獲得黃色的胚性愈傷組織； (2)胚性細胞懸浮培養(yǎng)系的建立在孔徑I.O毫米的金屬網中，用鑷子將胚性愈傷組織破碎，通過金屬網篩成直徑不超過I. O毫米的胚性細胞團；將O. I克的胚性細胞團接種于放有20毫升胚性細胞懸浮培養(yǎng)基的100毫升三角瓶中，在溫度26°C的，光照900 lux, 100轉/分鐘震蕩培養(yǎng)；繼代時用上述方法將增殖的胚性細胞團破碎，將O. I克的胚性細胞團轉移至放有20毫升胚性細胞懸浮培養(yǎng)基的100毫升三角瓶中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)，每周繼代一次。3周后，胚性細胞大量增殖，建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)系。其中所述胚性細胞懸浮培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時還含有3. O mg/L 的 6-BAU. O mg/L 的 2，4_D、30 g/L 的蔗糖，pH 值為 5. 8 ； (3)植株再生用孔徑I. O毫米的金屬網篩選直徑略大于I. O毫米的胚性懸浮細胞團，轉移至分化培養(yǎng)基中，在溫度26°C、光照強度為1200 lux，每日12小時光照環(huán)境中培養(yǎng)，6^10周后，形成綠色體細胞胚并進一步發(fā)育形成完整小植株。其中所述分化培養(yǎng)基為以1/10MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同時還含有O. 005 mg/L的6-BA、10 g/L的蔗糖和8g/L的瓊脂，pH值為5. 9。按上述條件培養(yǎng)，花燭胚性愈傷組織誘導率達96. 5% ;建立的胚性細胞懸浮培養(yǎng)系每周可增殖3. 02倍，每月可增殖83倍；獲得的胚性細胞團中，體細胞胚形成率達100% ；體細胞胚的植株再生率達55. 3 %。 實施例2 本實施例與實施例I不同的是取花燭品種‘阿拉巴馬’的幼嫩苗莖段，經表面消毒處理，切成10毫米截段，然后接種于體細胞胚誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得體細胞胚，其余與實施例I相同。按這種條件培養(yǎng)，花燭胚性愈傷組織誘導率達95. 1%。實施例3 本實施例與實施例I或2不同的是步驟(2)中胚性細胞懸浮培養(yǎng)基中含有2. O mg/L的6-BA、2. O mg/L的2，4_D，其余與實施例I或2相同。按這種條件培養(yǎng)，胚性細胞懸浮培養(yǎng)系每周可增殖2. 82倍，每月可增殖63倍以上。實施例4 本實施例與實施例I本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種花燭胚性細胞快速增殖并再生植株的方法，包括如下步驟：（a）誘導形成胚性愈傷組織；？？？（b）建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)系，獲得直徑1.0~2.0毫米的胚性細胞團；（c）利用步驟（b）獲得的胚性細胞團再生植株，其中所述建立胚性細胞懸浮培養(yǎng)系包括如下步驟：（b1）破碎所述胚性愈傷組織獲得直徑不超過1.0毫米的胚性細胞團；（b2）將0.1~0.2克的胚性細胞團接種于懸浮培養(yǎng)基中，在溫度25~27℃，光照800~1000？lux，90~110轉/分鐘震蕩培養(yǎng)，其中所述懸浮培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每1升基本培養(yǎng)基中添加2.0~3.0毫克的6？BA、1.0~2.0毫克的2,4？D、20~40克的蔗糖，pH值為5.6~6.0；（b3）6~8天繼代一次，繼代時將增殖的胚性細胞團破碎，將0.1~0.2克的胚性細胞團轉移至新鮮的懸浮培養(yǎng)基的中，按相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，3~4周后，獲得大量胚性細胞團。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：于波，廖飛雄，劉金梅，劉曉榮，朱根發(fā)，操君喜，李偉峰，
申請(專利權)人：廣東省農業(yè)科學院花卉研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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