提取楠木RNA的方法技術

本發明專利技術涉及提取楠木RNA的方法，屬于生物技術領域。本發明專利技術所解決的技術問題是提供了一種成本較低的提取楠木RNA的方法。本發明專利技術提取楠木RNA的方法包括如下步驟：按重量份取0.1份楠木葉片，磨成粉，然后加入到0.8～1.5份的預處理液中，再加入0.1～0.3份的乙酸乙酯，混勻，得到勻漿液；b、勻漿液靜置1～3分鐘；離心，溶液分為三層，棄去上面兩層，保留下層的沉淀；c、b步驟所得沉淀加入裂解劑裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等雜質；e、萃取、離心，所得上清液用異丙醇沉淀，所得沉淀用70～80wt%的乙醇溶液洗滌，得到楠木RNA。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及提取楠木RNA的方法，屬于生物

技術介紹
楠木為樟科常綠大喬木，分布區位于亞熱帶常綠闊葉林區西部，氣候溫暖濕潤，年平均溫17°C左右，I月平均溫7°C左右，年降水量140(Γ1600毫米。國家二級保護漸危種。楠木為我國特有，是馳名中外的珍貴用材樹種。四川有天然分布，是組成常綠闊葉林的主要樹種。由于歷代砍伐利用，致使這一豐富的森林資源近于枯竭。現存林分，多系人工栽培的半自然林和風景保護林，在廟宇、村舍、公園、庭院等處尚有少量的大樹，但病蟲危害較嚴重,也相繼在衰亡。為了更好地保護瀕臨滅絕的楠木，需要對楠木的生長環境、栽培育苗、生理指標、 資源分布等進行調查和研究，特別是采用現代分子生物學的手段對楠木RNA進行測序，更有利于楠木的育種研究。楠木RNA主要從楠木葉片中提取得到，楠木葉片富含芳香油(精油)、多糖、多酚類次級代謝產物成分，是楠木總RNA提取和純化試驗中最重要的干擾物質，也為后續的RNA結構和功能、cDNA文庫構建、楠木種子萌發以及材質發育相關基因的轉錄水平研究增加了困難。并且，楠木中RNA含量相對較低，這也是提取純化試驗中的難題。目前，對于RNA的提取方法主要有傳統的Trizol以及改良試劑方法，CTAB,Tris-SDS、異硫氰酸胍和皂土試劑等方法，另外，還有一些商業試劑盒等。但是上述方法用于提取楠木RNA時，卻存在一些缺陷。傳統的Trizol以及改良試劑方法不能獲得楠木葉片RNA ;而CTAB、Tris-SDS、異硫氰酸胍和皂土試劑等方法提取的楠木葉片總RNA含量和純度都很低，不能滿足文庫構建等研究的需求；使用國內以及國際的商業化試劑盒獲得的楠木葉片總RNA純度高，但較低的RNA含量相對提高了試驗費用。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種成本較低的提取楠木RNA的方法。本專利技術提取楠木RNA的方法包括如下步驟a、按重量份取O. I份楠木葉片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的預處理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混勻，得到勻漿液；其中，所述的預處理液為可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巰基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的濃度為2 4wt%，乙二胺四乙酸的濃度為80 UOmmolL-1，β -巰基乙醇的濃度為I. 5 2. 5%ν/ν ；b、勻漿液靜置I 3分鐘；離心，溶液分為三層，棄去上面兩層，保留下層的沉淀；c、b步驟所得沉淀加入裂解劑裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等雜質；e、萃取、離心，所得上清液用異丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗滌，得到楠木RNA。目前的RNA的提取方法一般都是直接進行裂解處理，沒有前處理步驟，本專利技術方法通過乙酸乙酯+預處理液處理，可以除去大部分精油脂類、糖類、酚類和色素類雜質，有利于提高楠木RNA純度。進一步的，為了提高除雜質效果，a步驟中所述的預處理液的溫度優選為40 440C。a步驟中所述的預處理液的溫度最優選為42°C。其中，為了提高除雜質效果，a步驟中所述的預處理液優選為可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巰基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的濃度為3wt%，乙二胺四乙酸的濃度為lOOmmolL—1，β-巰基乙醇的濃度為2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步驟可以按照常規方法進行。進一步的，為了提高楠木RNA純度，c步驟中所述的裂解劑優選為Tris-SDS裂解液，其組成為IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化鈉，I. 0%SDS，2%β -巰基乙醇，ρΗ=7. 5。 其中，為了提高楠木RNA純度，以使更多的糖類析出，上述方法的d步驟中裂解后的溶液除去多糖等雜質的方法優選為加入高鹽溶液和酸酚/氯仿溶液，混勻，離心，棄沉淀，所得上清液進入萃取步驟；所述的高鹽溶液為I. O I. 4mol/L氯化鈉和O. 6 I. Omol/L檸檬酸鈉的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液為酸酚和二氯甲烷按體積比1:1的混合溶液，并用醋酸鈉調節PH值至3. 7 ;高鹽溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的體積比為I. 6 2.4:2. 5 3. 5。進一步的，所述的高鹽溶液最優選為I. 2mol/L氯化鈉和O. 8mol/L檸檬酸鈉的混合溶液；所述的酸酚/ 二氯甲烷溶液為酸酚和二氯甲烷按體積比I I的混合溶液，并用醋酸鈉調節PH值至4. O ;高鹽溶液和酸酚/ 二氯甲烷溶液的體積比為2:3。本專利技術方法通過復合高鹽(氯化鈉和檸檬酸鈉的搭配)更利于多糖類的析出。其中，上述e步驟中，優選采用二氯甲烷萃取楠木RNA。本專利技術方法采用二氯甲烷萃取楠木，其效果優于三氯甲烷，除雜效果更好。其中，本專利技術方法適用于楠木屬的各種楠木RNA的提取,特別適合于楨楠PhoebezhennanS. Lee et FN WeiRNA 的提取。本專利技術方法通過乙二胺四乙酸鹽溶液與乙酸乙酯混合對楠木材料預處理抽提多種次級代謝產物，減少RNA提取過程中的雜質干擾與污染，所提取的楠木RNA的純度較高，所需試劑便宜，步驟簡單，本專利技術為楠木RNA的提取提供了一種新的方法，具有廣闊的應用前景。附圖說明圖I為不同RNA提取方法的瓊脂糖電泳比較結果圖。M :Marker(自上依次為2000、1000、750、500、250、100) ;A_B分別為Trizol和其改良試劑法；C :皂土法、D-E :CTAB法及其改良方法；F =Tris-SDS法；G :異硫氰酸胍法；H :試劑盒法；1 :本專利技術方法。具體實施例方式本專利技術提取楠木RNA的方法包括如下步驟a、按重量份取O. I份楠木葉片，磨成粉，然后加入到O. 8 I. 5份的預處理液中，再加入O. I O. 3份的乙酸乙酯，混勻，得到勻漿液；其中，所述的預處理液為可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巰基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的濃度為2 4wt%，乙二胺四乙酸的濃度為80 UOmmolL-1，β -巰基乙醇的濃度為I. 5 2. 5%ν/ν ；b、勻漿液靜置I 3分鐘；離心，溶液分為三層，棄去上面兩層，保留下層的沉淀；C、b步驟所得沉淀加入裂解劑裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等雜質；e、萃取、離心，所得上清液用異丙醇沉淀，所得沉淀用70 80wt%的乙醇溶液洗滌，得到楠木RNA。目前的RNA的提取方法一般都是直接進行裂解處理，沒有前處理步驟，本專利技術方法通過乙酸乙酯+預處理液處理，可以除去大部分精油脂類、糖類、酚類和色素類雜質，有利于提高楠木RNA純度。·進一步的，為了提高除雜質效果，a步驟中所述的預處理液的溫度優選為40 440C。a步驟中所述的預處理液的溫度最優選為42°C。其中，為了提高除雜質效果，a步驟中所述的預處理液優選為可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、巰基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的濃度為3wt%，乙二胺四乙酸的濃度為lOOmmolL—1，β-巰基乙醇的濃度為2%ν/ν。其中，上述方法的C、d、e步驟可以按照常規方法進行。進一步的，為了提高楠木RNA純度，c步驟中所述的裂解劑優選為Tris-SDS裂解液，其組成為IOOmmoI/L Tris-HCl,400mmol/L 氯化鈉，I. 0%SDS，2%β -巰基乙醇，ρΗ=7. 5。其中，為了提本文檔來自技高網...

【技術保護點】
提取楠木RNA的方法，其特征在于包括如下步驟：a、按重量份取0.1份楠木葉片，磨成粉，然后加入到0.8～1.5份的預處理液中，再加入0.1～0.3份的乙酸乙酯，混勻，得到勻漿液；其中，所述的預處理液為：可溶性聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、β？巰基乙醇的混合溶液，可溶性聚乙烯吡咯烷酮的濃度為2～4wt%，乙二胺四乙酸的濃度為80～120mmolL？1，β？巰基乙醇的濃度為1.5～2.5%v/v；b、勻漿液靜置1～3分鐘；離心，溶液分為三層，棄去上面兩層，保留下層的沉淀；c、b步驟所得沉淀加入裂解劑裂解；d、裂解后的溶液除去多糖等雜質；e、萃取、離心，所得上清液用異丙醇沉淀，所得沉淀用70～80wt%的乙醇溶液洗滌，得到楠木RNA。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：莊國慶，龍漢利，李曉清，
申請(專利權)人：四川省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：