本發明專利技術公開了一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉化中的應用方法，該方法構建了甘露糖無抗生素篩選標記載體，通過農桿菌介導將磷酸甘露糖異構酶（PMI基因）和報告基因（GUS基因）轉入麻瘋樹細胞中，利用甘露糖替代抗生素作為選擇劑，對轉化后的受體細胞進行篩選，并且通過PCR方法對轉基因植株進行檢測，說明被轉化基因在細胞中得到了表達。采用本發明專利技術提供的技術方案，對麻瘋樹葉盤的轉化能成功地獲得了抗性不定芽，甘露糖無抗生素標篩選的遺傳轉化率達到10%以上，是抗生素標記的2倍，轉化效率高，檢測方便，提高了轉基因植物的生物安全性，能有效消除抗生素對環境潛在的不利影響。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物轉基因
，具體涉及。
技術介紹
麻瘋樹是國際上研究最多的能生產生物柴油的能源植物之一，開展遺傳轉化能極大的促進麻瘋樹遺傳育種的研究。鑒于麻瘋樹基因轉化工作難度大，目前國內外關于這方面的報道還不是很多，而且已有研究用于麻瘋樹轉化的選擇標記系統都是采用潮霉素、卡拉霉素等抗生素或除草劑進行抗性篩選。這類藥物對植株轉化有較大影響，會影響轉化細胞的生長及再生，尤其是像麻瘋樹這類的木本植物，采用傳統的抗生素或除草劑等篩選方法獲得轉基因芽、再生根相當困難。另外，標記基因的安全性從一開始就受到了廣泛爭論。雖然也有不少手段可以去除轉基因植物中的標記基因。但大多效率不高，或者需要進行子·代雜交，這對木本植物來說不是十分現實。隨著研究的不斷深入，甘露糖篩選體系作為一種新型正向的篩選方法已受到了越來越多的人的關注。該體系是以大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因PMI為篩選標記基因,D-甘露糖為篩選劑進行篩選。1998年Joersbo小組報道了首例PMI轉基因甜菜，隨后對影響轉化效率的因素作了大量的研究。雖然PMI/甘露糖篩選體系研究歷史較短，僅有部分植物采用了該體系，但有由模式植物向經濟作物發展的趨勢。對一些難生根的作物，尤其是木本植物，相對抗生素篩選而言，甘露糖篩選對轉基因芽生根能力的抑制要輕得多。2003年巴西的Boscariol等用帶有PMI基因的農桿菌感染4種甜橙實生苗上胚軸，以甘露糖為碳源和篩選劑，其轉化率在39Γ23. 8%之間，表明了該體系的有效性和安全性。雖然PMI/甘露糖篩選體目前已成功用于甜菜、擬南芥、玉米、小麥、水稻、大麥等多種植物轉化，在木本植物甜橙和葡萄等上也有研究。但在麻瘋樹遺傳轉化中還尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是在于克服現有技術的不足，提供一種利用PMI (磷酸甘露糖異構酶)/甘露糖篩選體系在麻瘋樹基因轉化中的應用方法，以提高麻瘋樹基因轉化的效率。為達到以上目的，本專利技術的技術方案為，依次包括以下步驟I)克隆6磷酸-甘露糖異構酶基因(該基因序列在ncbi上面公開)，構建甘露糖篩選標記的植物表達載體，并將載體導入農桿菌中；2)將經過預培養的麻瘋樹的葉盤外植體與農桿菌在感染培養基中感染轉化，然后在共培養培養基中共培養，再依次轉入篩選培養基、芽伸長培養基和生根培養基中進行培養，獲得轉基因植株。步驟I)所述的植物表達載體是雙元載體pC1304PMI，(由6磷酸-甘露糖異構酶基因替換植物表達載體中的hpt基因)包含6磷酸-甘露糖異構酶基因和GUS報告基因。步驟2)中麻瘋樹的葉盤外植體預培養的培養基MS培養基中含lmg/LTDZ，O. 5mg/LI BA, I. 5mg/L6-BA, 2mg/LSNP ；SNP 是 Sodium Nitroprusside (硝普鈉)，TDZ 是一種細胞分裂素，全稱是Thidiazuron。感染培養基用MS液體培養基稀釋農桿菌菌液30倍得到，附加O. 02mmol/L乙酰丁香酮，共培養培養基SR預培養基。步驟2)所述的篩選培養基SR培養基中含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖為糖源，附加500mg/L頭孢霉素。 步驟2)所述的芽伸長培養基MS培養基中含O. lmg/L6-BA和O. 005mg/LIBA,附加500mg/L頭孢霉素；生根培養基MS培養基中含O. 3mg/LIBA,附加500mg/L頭孢霉素。步驟2)中麻瘋樹的葉盤外植體的預培養過程如下選取生長旺盛的麻瘋樹頂端幼嫩葉片，在無菌條件下用質量濃度20%的NaClO溶液(有效氯濃度為2%)消毒20分鐘，無菌水洗滌三遍，切成大小為9mm2葉盤，近軸端朝上置于SR培養基中預培養14天，再進行感染轉化。所述的感染培養基的制備過程如下通過電轉化法將載體PC1304PMI導入根癌農桿菌GV3101中，將轉化細菌的單個菌落接種到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液體LB培養基中；在28°C下培養細菌生長直到0D600值達到O. 6，得到農桿菌菌液，然后用MS液體培養基稀釋30倍，附加O. 02mmol/L乙酰丁香酮，作為感染培養基。步驟2)中具體是將預培養后的葉盤浸泡于感染培養基中10分鐘，取出外植體，用滅菌濾紙吸干外植體表面的菌液，將浸泡過的外植體接種到SR培養基中在25°C在黑暗條件下共培養2天，直至在培養基上看到菌斑。本專利技術方法中將共培養后的外植體轉入篩選培養基，在25°C黑暗條件下培養三周，將得到的抗性芽從愈傷組織上轉移到芽伸長培養基進行抗性芽的拉長培育，當拉長的抗性芽高度達到2厘米時，轉入生根培養基中培養20天，得到轉化植株。本專利技術的優勢己報道的麻瘋樹農桿菌介導的轉化中一般都利用抗生素進行篩選，抗生素的篩選加大了愈傷的死亡率，轉化率僅5%左右。本專利技術克服了現有技術的不足，打破了麻瘋樹遺傳轉化基因型的限制，利用甘露糖為選擇劑，研制了一種簡便高效的農桿菌轉化方法。本專利技術所采用農桿菌介導遺傳轉化的麻瘋樹轉化率最高達到10%(見表I)，對得到的抗性苗通過PCR檢測，驗證轉化成功。本專利技術的方法簡單，操作簡便，結果可靠，生物安全性高，具有廣泛的應用價值。附圖說明圖I:篩選培養基中的麻瘋樹抗性芽，A為從外植體中移植的抗性芽；B為在芽伸長培養基中培養30天后的伸長芽；圖2 :不同的選擇性標記對麻瘋樹葉盤轉化的影響，A和B為甘露糖篩選的外植體，C和D為卡拉霉素篩選的外植體；圖3:PCR檢測圖譜分析從甘露糖抗性植株葉片上分離出的DNA進行引物特異性擴增的484-bp片斷⑶S基因，泳道I為陽性對照，泳道2-3為水的空白對照，泳道4-5為陰性對照(未轉化的植株)，泳道6-17為甘露糖抗性植株；其中有條帶的是陽性，無條帶是假陽性。具體實施例方式以下實施例旨在進一步說明本專利技術，而不用于限制本專利技術要求保護的范圍。實施例II.農桿菌介導的無抗生素轉化麻瘋樹 從溫室取幼嫩葉片消毒后，切成9_2，將葉片的遠軸面置于培養基中預培養14天，再進行轉化。構建雙元載體PC1304PMI，其中包括PMI基因(即6磷酸-甘露糖異構酶基因)作為篩選基因和GUS基因作為報告基因，(PC1304PMI載體是根據文獻方法構建的，參考文獻PMI基因作為選擇標記的植物表達載體構建及其在雪柑轉基因中的應用農業生物技術學報 Journal of Agricultural Biotechnology 2008，16 (5) : 858-864。)。通過電轉化法將載體導入根癌農桿菌GV3101 (購于北京北納創聯生物技術研究院)中，將轉化細菌的單個菌落接種到含50mg/L卡拉霉素和50mg/L利福平的液體LB培養基中。在28°C下培養細菌生長直到0D600值達到0. 6，然后用MS液體培養基稀釋30倍，用作為感染培養基。在感染培養基中添加誘導劑乙酰丁香酮0. 02mmol/L，將預培養14天的葉盤培養物接種在感染培養基中培養10分鐘，再轉入SR培養基中在25°C黑暗條件下進行共培養。共培養2天后，將外植體轉入篩選培養基(SR預培養基含10g/L蔗糖和20g/L甘露糖為糖源，附加500mg/L頭孢霉素控制細菌生長)，三周后，將抗性芽從愈傷組織上轉移到含500mg/L頭孢霉素的芽伸長培養基中進行用于抗性芽的拉長培育，拉長的抗性芽達到2厘米高度時，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種無抗生素篩選標記在麻瘋樹基因轉化中的應用方法，其特征在于，依次包括以下步驟：1)克隆6磷酸？甘露糖異構酶基因，構建甘露糖篩選標記的植物表達載體，并將載體導入農桿菌中；2）將經過預培養的麻瘋樹的葉盤外植體與農桿菌在感染培養基中感染轉化，然后在共培養培養基中共培養，再依次轉入篩選培養基、芽伸長培養基和生根培養基中進行培養，獲得轉基因植株。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳介南，盧孟柱，劉伯斌，王瓊，
申請(專利權)人：中南林業科技大學，
類型：發明
國別省市：
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