用于經典豬瘟的標記疫苗制造技術

本發明專利技術涉及一種用于預防性治療經典豬瘟的標記疫苗，其包含修飾的減毒活經典豬瘟病毒。E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含與野生型經典豬瘟病毒不同的序列。本發明專利技術涉及這種標記疫苗的藥物組合物。本發明專利技術還涉及一種使用選擇性抗體壓力制造用于預防經典豬瘟的標記疫苗的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于經典豬瘟的標記疫苗描述本專利技術涉及一種用于預防性治療經典豬瘟的標記疫苗，其包含修飾的減毒活經典豬瘟病毒。在本專利技術的一個實施方案中，這種標記疫苗的特征在于，編碼TAV-表位的病毒核苷酸序列和/或TAV-表位的氨基酸序列包含與疾病相關性豬瘟病毒不同的序列，從而可以通過血清學和/或基因組分析方法，將顯示疾病相關性豬瘟病毒感染的受試者與用本專利技術標記疫苗接種的受試者區分。專利技術背景 經典豬瘟(CSF)是在世界范圍發生并且具有重大政治及經濟意義的一種流行性動物疾病(Vand印utte和ChappuiS，1999)。經典豬瘟，也稱作豬霍亂或豬瘟疫(pigplague)，是一旦在任何成員國中出現必須在歐盟層面以及向世界動物衛生組織(OIE)作出國際通報的疾病之一。經典豬瘟由黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的一種小的包膜RNA病毒引起。豬瘟病毒的天然宿主僅是家養和野生的豬物種(例如，歐洲野豬)。已經在歐盟內部嘗試在不預防性接種情況下通過嚴厲措施根除CSF，自1990以來已經禁用預防性接種。盡管禁用，然而作為緊急接種，在豬瘟出現的情況下，接種仍代表法律批準的選項。在這種情況下中，接種應當通過緊急接種計劃之一進行，這些計劃已經由歐盟批準(見理事會指令第19號，2001/89/EC)。直至現在，羅馬尼亞是已經實施過緊急接種的唯一國家。這種有限應用的原因在于當前可獲得的標記疫苗的技術性約束，如疫苗效力限制，此外還有涉及常規接種動物的貿易壁壘(對國際銷售的限制)。許可的標記疫苗的效率不能與顯示明顯優點的修飾的活疫苗相比，并且這些滅活疫苗或亞單位疫苗無論如何不適合用于緊急接種，原因在于免疫力發動較晚和需要再接種。考慮歐盟向東歐國家擴大和日益增加的全球化，已經討論了用于潛在緊急接種的新策略，其將在避免大規模剔除動物和相關經濟損失方面發揮重要作用的(Leifer等人，2009)。因此對于高度有效的疫苗存在迫切需要，這種疫苗允許在接種和未接種的動物之間進行血清學區分并且還顯示傳統修飾的活疫苗的全部優點。因為基于CSF病毒E2糖蛋白的第一代標記疫苗僅具有受限制的可獲得性和嚴重缺點，如儲存條件、成本、效力，所以對新的標記疫苗存在巨大需求。已經研究了這類疫苗的多種候選物，如DNA疫苗、免疫原性肽、載體疫苗、缺失突變體和嵌合豬瘟病毒(Beer等人，2007 ；Dong和Chen, 2007)。這些標記疫苗候選物的大部分顯示以下缺點它們通過現代基因修飾方法產生。除復雜的準許程序之外，還由于顧客明顯懼怕基因修飾的產品，基因修飾的疫苗顯示明顯的缺點。針對CSFV的傳統疫苗包括修飾的活疫苗。這類疫苗在單次應用后是高度有效的，但是不允許基于血清學譜區分接種動物和感染動物。這些疫苗中的多種基于經典毒株“C”或其衍生物(所謂“C-株疫苗”)。另外，存在基于日本毒株“豚鼠興奮陰性(GPE-)”、“Thiverval”株和“墨西哥PAV”株的疫苗，這些疫苗均已經在地區和國際環境下使用(Blome 等人，2006 ;Greiser_Wilke 和 Moennig, 2004 ；van Oirschot, 2003)。的確存在關于使用C-株疫苗的廣泛數據。已知在應用這種疫苗4日后，可以顯示動物受到抗強毒CSFV攻毒感染的完全保護。另外，接種后7日，在攜帶動物中提供免于攻毒病毒垂直傳播的完全保護(de Smit 等人，2001)。已知的修飾活疫苗的明顯缺點是完全不能血清學地區分接種動物和感染動物。有鑒于此，本專利技術的一項任務是提供一種能夠區分接種動物和感染動物的修飾活疫苗。在標記疫苗領域，所謂的亞單位疫苗是現有技術已知的，這些亞單位疫苗基于CSFV的重組E2糖蛋白。這類疫苗的區分試驗是酶聯免疫吸附測定(ELISA)，其中針對Ems糖蛋白的抗體用來間接地檢測CSF病毒感染。在目前，僅一種E2-亞單位疫苗是市場上可獲得的，然而，許可證延遲了幾個月(見EMA (歐洲藥品管理局)關于E2亞單位疫苗的報道)。姑且不論不能銷售這類產產品，這些系統顯示嚴重的生物學缺點。一個這樣的缺點是，在傳遞完全保護之前需要至少兩次腸胃外免疫，這導致此類疫苗與以單次劑量用疫苗餌料飼喂動物的“餌料接種法”完全不匹配。此外，緊急接種計劃僅在多個實驗中使用針對野生型CSFV的E2亞單位疫苗保護時，沒有實現免遭垂直傳播的完全保護的情況下才是合理的。這類系統的另一個缺點是，針對糖蛋白Ems的抗體用于血清學區分并且這類檢驗體系的靈敏度和特異性僅是略微中等的(Floegel-Niesmann，2003)。活的減毒CSF疫苗是本領域已知的，但是至今受困于多種缺點。現有技術中公開的大部分疫苗包含外來DNA并且使用基因工程方法(也稱作重組DNA技術)產生，因此嚴重的環境風險評估問題伴隨這種產品。已知其中從野生型TAV表位中置換或缺失氨基酸的其他CSFV變體(WO 2010/074575A2)。然而，在本專利技術中修飾的氨基酸殘基和/或核苷酸在現有技術中既沒有公開，有沒有提示。多次傳代也已經被用來產生可以用作疫苗的病毒變體，不過先前沒有應用抗體壓力。如現有技術中公開的旨在產生變體的病毒感染培養物的多次傳代因此受到以下限制不得不實施大量培養物傳代并且還無法控制將要修飾哪個表位(Hulst等人)。Kortekaas等人描述一種遺傳穩定的、活的減毒CSF疫苗，所述疫苗能夠血清學地將感染動物與接種動物區分。將突變的C-株使用定向方法進行基因修飾，由此使用重組DNA技術來將缺失引入CSFV的E2蛋白中。通過多次傳代在病毒基因組內部的多個位置隨后獲得其他突變，以產生顯示增殖增強的毒株。在Kortekaas等人中公開的毒株是基因修飾的病毒，考慮到用于釋放基因修飾產物至環境中的復雜準許過程，這是一個明顯缺點。Holinka等人公開了一種減毒的雙抗原標記活CSFV毒株“FlagT4vn”，其中通過組合兩個減毒遺傳定子獲得所述毒株。FlagT4v攜帶通過在El糖蛋白中19聚物插入所導入的陽性抗原標記(合成性Flag表位)和因突變E2糖蛋白中的單克隆抗體WH303(mAbWH303)表位的結合位點所產生的陰性標記。鼻內或肌內施用FlagT4v保護豬在接種后早期(2或3H )和晚期(28 H )時間免遭強毒CSFV Brescia株影響。FlagT4v在豬中誘導針對Flag表位強烈反應的抗體應答，但是不能抑制mAb WH303與代表WH303表位的合成肽結合。在Holinka中公開的疫苗涉及一種基因工程病毒，所述病毒在其基因組內顯示外來DNA(除相關的載體序列和標記之外還有FLAG-標簽序列)。與不顯示外來或重組DNA的本專利技術相比，這表示一個明顯缺點。文獻WO 2007/143442A2描述了在CSFV E2的WH303表位內部突變的效果，所述突變將強毒Brescia CSFV的氨基酸序列逐步向BVDV毒株NADL的同源性氨基酸序列改變。在接種后第3日和21日用強毒Brescia病毒攻毒時，被病毒突變體感染的動物受到保護。在WH303表位內部這個位點處的修飾還導致開發區分接種動物與感染動物的診斷試驗。即便存在這些效果，然而使用基因工程引入這些突變，因此將外來遺傳物質導入病毒疫苗中。上述的現有技術公本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬丁·貝爾，桑德拉·布洛梅，伊曼紐爾·萊費爾，
申請(專利權)人：里姆瑟藥物股份公司，
類型：
國別省市：