本發明專利技術提供了一種重組人G-CSF(rhG-CSF)二聚體，其具有比GCSF延長的血清半衰期和增強的生物活性，其中，所述的二聚體由二個G-CSF-Fc復合物通過Fc片段的二硫鍵配對形成，并且所述G-CSF-Fc復合物包含：G-CSF單體、IgG2的Fc片段、以及連接所述G-CSF單體和Fc片段的肽。所述的rhG-CSF可用于治療神經性疾病。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生物學和醫學
，特別地，本專利技術涉及一種新的人G-CSF 二聚體及其在治療伴隨神經損傷的疾病中的用途。
技術介紹
人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種含有204個氨基酸和30個氨基酸信號肽的糖蛋白。成熟的G-CSF蛋白分子量為18-20kDa，由174個氨基酸構成，不含信號肽，并被分泌到細胞外。主要負責這類分泌的人類細胞為單核細胞、成纖維細胞、和內皮細胞。G-CSF主要具有三大生物學功能，即I.作用于骨髓前體細胞和干細胞，從而驅動嗜中性粒細胞的分化、發育和成熟；2.激活成熟的嗜中性粒細胞，參與免疫反應；和3.作用于其他造血生長因子，如干細胞因子、Flt-3配體、和GM-CSF，從而動員造血干細胞。G-CSF受體(G-CSFR)已證實存在于骨髓造血干細胞Sca+LirTThllm、前體細胞0)34+、以及定向分化的嗜中性粒前體細胞(committed granulocyteprecursor)、和成熟的嗜中性粒細胞。G-CSFR是一種對G-CSF有高親合力的特異性受體，具有812個氨基酸。Tamada等人獲得了 G-CSF: G-CSFR復合物的晶體結構，2. 8埃衍射分析(PNAS，2008,Vol. 103:3135-3140)顯示G-CSF:G_CSFR復合物是以2 2比例存在。換言之，每個復合物中，每一個G-CSF結合于一個受體鏈，從而形成G-CSF-受體復合物，當兩個G-CSF-受體復合物相互靠近，相互作用形成2:2 二聚體。在這種情況下，G-CSF受體的羧基端才能激活下游的信號分子JAK2 (Janus tyrosinekinase，主要是JAK2)。因此，JAK2激活STAT3，從而啟動對嗜中性粒細胞分化、增殖和激活至關重要的基因的轉錄。2003年，Schabitz W. R等報道，重組人G-CSF (rhG-CSF)對神經細胞在缺血性動物模型中具有保護功能(Stroke，2003, 34:745-751)。2006年后期，Shyu等報道，連續5天每天給病人施用重組人G-CSF，表明，rhG-CSF在急性中風病人的治療中具有臨床效果(CMAJ，2006,174:927-933)。皮下給藥，鼠G-CSF在體內的半衰期約2小時，而人G-CSF的皮下給藥半衰期只有3. 5小時，因此，需要給需要的病人每天施用，或靜脈注射藥物，這會影響病人的生活質量。
技術實現思路
鑒于前述背景，本專利技術的目的是提供一種用于更有效治療伴隨神經損傷的疾病的替代藥物及其制法。因此，在本專利技術的第一方面，提供了一種式I所示的G-CSF 二聚體(I) M1-L-M2其中，Ml是G-C SF的第一單體；M2是G-CSF的第二單體山是連接所述第一單體和第二單體的接頭(linker),并位于所述第一單體和第二單體之間。并且，所述的G-CSF 二聚體保持G-CSF單體的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一或第二單體的2倍以上。在本專利技術的一個優選例中，所述的L選自下組a)有機接頭；b)包含3-50個氨基酸的短肽；以及c)式II所示的多肽(II) -Z-Y-Z-其中，Y為載體蛋白；Z為包含0-30個氨基酸的短肽。在另一優選例中，沒有氨基酸的短肽是指肽健。在另一優選例中，接頭對G-CSF 二聚體具有足夠小的空間位阻，以至于不影響或不顯著影響第一單體和第二單體形成的正確的折疊和構象。在一個優選例中，有機接頭選自下組氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenyIacetamidomethyI) (PAM)樹脂、4_氧甲基-苯基乙酸胺基甲基樹脂(4-oxymethyl phenyIacetamidomethyI resin)、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂(chloromethylpolystyrene resin)。在另一優選例中，所述的第一單體和第二單體是相同的。在一個優選例中，所述融合蛋白的生物活性包括(a)作用于嗜中性粒細胞和干細胞，從而驅動嗜中性粒細胞的分化、生長和成熟；和(b)激活成熟的嗜中性粒細胞,參與免疫反應。在另一優選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fe片段。在一個優選例中，所述的G-CSF 二聚體的血清半衰期是所述第一和/或第二單體血清半衰期的3倍以上、5倍以上、或10倍以上。在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體由兩個G-CSF-Fc復合物制得，其中，每個G-CSF-Fc復合物包含一個選自SEQ ID NO:2_7的氨基酸序列。在本專利技術的另一方面，提供了一種由第一多肽和第二多肽制備的融合蛋白，其中，所述的第一多肽和第二多肽包含一段如SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，且兩個多肽無空間位阻地連接。在一個優選例中，所述的第一和第二多肽為G-CSF單體。在本專利技術的另一優選例中，所述的第一多肽和第二多肽之間的無位阻地連接通過接頭實現。在該實施例中，所述的接頭為a).具有足夠小空間位阻的有機接頭，不影響或不顯著影響第一單體和第二單體形成的正確的折疊和構象；b).包含3-50個氨基酸的短肽；以及c).式II所示的多肽(II) -Z-Y-Z-其中，Y為載體蛋白；Z為包含0-30個氨基酸的短肽。在一個優選例中，所述的沒有氨基酸的短肽是指肽健。在另一優選例中，所述的有機接頭為氧甲基苯基乙酰胺基甲基(oxymethylphenyIacetamidomethyI) (PAM)樹脂、4_氧甲基-苯基乙酸胺基甲基樹脂(4-oxymethyl phenyIacetamidomethyI resin)、和氯甲基化聚苯乙烯樹脂(chloromethylpolystyrene resin)。在本專利技術的另一方面，提供了一種包含以由兩個G-CSF-Fc復合物制得的純化的G-CSF 二聚體作為活性成分的藥物組合物，其中，每個G-CSF-Fc復合物包含一段選自SEQID N0:2-7的氨基酸序列。在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為90-100%;在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為95-100% ;在另一優選例中，所述的G-CSF 二聚體的純度為99-100%。在該特定方面的一個優選例中，提供了一種治療神經系統疾病(neurologicaldisorder)的方法,包括給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在另一優選例中，所述的有效量為0. OOl-IOOOmg 二聚體每劑。在另一優選例中，所述的疾病選自下組中風、脊柱損傷、以及伴隨著血腦屏障損傷的神經系統疾病。在該特定方面的另一優選例中，提供了一種激活神經細胞中STAT3的方法，包括給需要治療的對象施用有效量的前述的藥物組合物。在另一優選例中，所述的有效量為0.OOl-IOOOmg 聚體每劑。 在本專利技術的另一方面，提供了一種分離的包含如SEQ ID NO:2_7任一所示的氨基酸序列的多肽。在一個實施例中，提供了一種以包含如SEQ ID N0:2-7任一所示的氨基酸序列的純化的多肽作為活性成分的藥物組合物。在一個優選例中，所述多肽的純度為90-100% ;在另一優選例中，所述多肽的純度為95-100% ;在另一優選例中，所述多肽的純度為 99-100%。在該特定方面的一個優選例中，提供了一種治療神經系統疾病的方法，包括給需要治療的對象施用有本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴孝強，黃智華，楊紅舟，孫乃超，黃予良，
申請(專利權)人：健能隆醫藥技術上海有限公司，
類型：
國別省市：
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