本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟：1)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV，用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗；2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞；3)在無菌條件下收集卵黃；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，合格后無菌分裝。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果：卵黃抗體注射液能有針對性的對PRRSV、PCV2和豬肺炎支原體單獨(dú)感染或混合感染病豬進(jìn)行有效的治療。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于獸醫(yī)生物制品
，具體涉及一種治療豬呼吸道疾病的卵黃抗體的制備方法。
技術(shù)介紹
豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)以生長速度降低、飼料利用率降低、食欲減退、咳嗽、呼吸困難為特征的疾病，雖然總體死亡率不高，但可嚴(yán)重影響豬場的經(jīng)濟(jì)效益。臨床上引起豬呼吸道綜合癥的主要病原有豬肺炎支原體、繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、2型圓環(huán)病毒(PCV-2)和豬流感病毒，以及繼發(fā)感染的其它細(xì)菌性病原，如巴氏桿菌、鏈球菌和胸膜肺炎放線桿菌等病原。斷奶后各個階段的豬均可發(fā)病，即從斷奶后2周開始，一直到育肥期都可能發(fā)生呼吸道疾病綜合癥。 PRRSV是一種免疫抑制性病毒，感染后可以產(chǎn)生病毒血癥，除引起繁殖障礙外，尚可以引起全身淋巴系統(tǒng)，特別是肺臟巨噬細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，從而促進(jìn)了包括肺炎支原體、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌在內(nèi)的等多種病原體感染。最近幾年的PCV-2與PRRSV也有顯著的協(xié)同作用。肺炎支原體一方面可以破壞呼吸道的局部清除病原體的能力，使得細(xì)菌性病原體嚴(yán)重繼發(fā)感染；另一方面，通過研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體可以調(diào)制肺臟局部的免疫應(yīng)答，使肺泡巨噬細(xì)胞的的功能發(fā)生改變，從而促進(jìn)了 PRRSV的感染，延長了 PRRSV感染的時(shí)間，加重了 PRRSV造成的損失。最近的研究表明，肺炎支原體還可以促進(jìn)PCV-2的感染。美國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在呼吸道疾病綜合癥(PRDC)的臨床病例中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)肺炎支原體與PCV-2混合感染，而不一定有PRRSV或流感病毒的存在。PCV-2的抗原經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于有肺炎支原體感染誘導(dǎo)增生的支氣管周圍淋巴組織區(qū)域。PCV-2/肺炎支原體的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原體單獨(dú)感染只能引起輕微的一過性呼吸道疾病和病變，但如果二者混合感染，可導(dǎo)致嚴(yán)重的與PRDC和PMWS —致的呼吸道疾病癥狀和病變。因?yàn)镻RDC的發(fā)生既有感染的因素，又有營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理以及豬舍環(huán)境的因素，因此豬場通常采用綜合性措施加以控制，如疫苗免疫，藥物預(yù)防以及加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等。通過綜合性的預(yù)防措施雖然可以起到一定的效果，但是由于PRRSV、PCV2等疾病的免疫抑制作用，通常在帶毒豬場免疫效果并不理想，并且PRRSV對不同來源的毒株的保護(hù)力較低，在帶毒豬場免疫PRRSV可能導(dǎo)致PRRSV的爆發(fā)，給豬場造成巨大的損失。肺炎支原體免疫可以減輕PRRSV的感染，預(yù)防PRDC ;但PRRSV感染又可干擾肺炎支原體的免疫。如果在肺炎支原體免疫前感染了 PRRSV或PCV2，則肺炎支原體的免疫效果明顯降低。另外由于PRDC的發(fā)生是病毒/細(xì)菌以及支原體混合感染的結(jié)果，通常可以使用廣譜抗生素對細(xì)菌性病原進(jìn)行清除，如使用金霉素、阿莫西林和氟苯尼考等抗生素，這些藥物通常可以控制大多數(shù)呼吸道細(xì)菌性病原體的感染。但抗生素的大量運(yùn)用一方面將導(dǎo)致更多耐藥菌株的出現(xiàn)，增加疾病防控成本，另一方面也給食品安全帶來了隱患。目前，卵黃抗體已經(jīng)廣泛運(yùn)用于雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動物疾病的緊急治療和預(yù)防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，制備簡單，容易提取，可以高效特異的對病毒性/細(xì)菌性疾病進(jìn)行治療；而且雞大規(guī)模工業(yè)化飼養(yǎng)成本低，經(jīng)濟(jì)方便。同時(shí)使用卵黃抗體進(jìn)行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現(xiàn)，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物制品的開發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運(yùn)用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合癥的研究尚未有報(bào)到。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，用于防治豬呼吸道綜合癥，克服已有技術(shù)中的缺點(diǎn)，在降低防疫成本和耐藥性菌株產(chǎn)生的前提下，有效的提高動物的生產(chǎn)性能和疫病防治效果，且不會對人產(chǎn)生食源性污染和藥物殘留。本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)·一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟I)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV,用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗。制備的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低于108/ml，PCV-2的TCID5tl不低于10%1，豬肺炎支原體數(shù)量不低于IOltVml ；2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞，免疫程序如下與產(chǎn)蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為3ml/羽。此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導(dǎo)母雞持續(xù)性的產(chǎn)生抗PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體的抗體；3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運(yùn)用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量磷酸鹽緩沖液(O. IM PBS,PH7. 2)后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PRRSV、PCV_2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，合格后無菌分裝，使PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價(jià)不低于I : 64。本專利技術(shù)的有益效果為本專利技術(shù)中制備的卵黃抗體注射液為免疫球蛋白制劑，能夠特異性的中和PRRSV、PCV2，同時(shí)對豬肺炎支原體亦具有作用，可用于臨床上由PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體混合感染導(dǎo)致的豬呼吸道綜合癥；使用本專利技術(shù)中制備的注射液不僅可以治愈易感染上述病原的豬，同時(shí)對同群未感染上述病原的豬使用可以使其獲得被動免疫；臨床實(shí)驗(yàn)表明，使用本專利技術(shù)制備的產(chǎn)品后可以顯著提高豬群生產(chǎn)性能；本專利技術(shù)制備成本低，見效快，本制品無毒副作用，使用后無藥物殘留，生產(chǎn)使用過程中對人畜無危害，同時(shí)使用本專利技術(shù)中制備的產(chǎn)品不會導(dǎo)致耐藥菌毒株的出現(xiàn)，對食品安全無潛在的危害，適宜大規(guī)模推廣。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :PRRSV流行毒株的分離鑒定以及病毒TCID5tl測定I、PRRSV流行毒株的分離鑒定I)采集疑似PRRSV發(fā)病豬血清，接種MARC-145細(xì)胞，37°C，5% C02培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，如培養(yǎng)至96小時(shí)后無細(xì)胞病變出現(xiàn)則將細(xì)胞培養(yǎng)物置_40°C反復(fù)凍融三次，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清接種MARC-145細(xì)胞繼續(xù)傳代。以此類推連續(xù)進(jìn)行傳代。該分離毒株傳代至第2代時(shí)在接種72小時(shí) 后出現(xiàn)細(xì)胞病變。2)根據(jù)GENBANK中登錄的PRRSV的序列(AY150564)設(shè)計(jì)一對特異性引物P1、P2。其中 Pl CCGACTGCTAGGGCTTCT,P2 :TATCTGCCACCCAACACG 擴(kuò)增片段大小為 363bp。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液上清提取RNA，運(yùn)用RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行PCR鑒定。如擴(kuò)增出特異性的片段則判定為PRRSV陽性本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV？2和豬肺炎支原體，分別用MARC？145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV，用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV？2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗；2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞；3)在無菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量的PH7.2的0.1M？PBS后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿1分鐘，加入乳酸至PH為4.0，2～8℃攪拌過夜，置？80℃冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照1∶1的比例加入飽和硫酸銨，2～8℃攪拌2消失，后2～8℃靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入0.1M？PBS溶解后除去硫酸銨；4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PRRSV、PCV？2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價(jià)；5)將效價(jià)測定好的卵黃抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，合格后無菌分裝，使PRRSV、PCV？2和豬肺炎支原體抗體效價(jià)不低于1∶64。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種治療豬呼吸綜合癥的卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)分離當(dāng)前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV，用PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV-2和支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度后制備成三聯(lián)滅活疫苗； 2)利用制備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯(lián)滅活疫苗免疫非免疫產(chǎn)蛋母雞； 3)在無菌條件下收集卵黃，運(yùn)用等量的PH7.2的O. IM PBS后置組織勻漿器中，5000轉(zhuǎn)/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置_80°C冷凍后解凍，并重復(fù)冷凍一次，然后8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，后2 8°C靜置過夜，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸銨； 4)運(yùn)用微量中和實(shí)驗(yàn)測定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價(jià)，運(yùn)用ELISA測定豬肺炎支原體抗體...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李帥偉，龐程，
申請(專利權(quán))人：廣州格拉姆生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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