本發明專利技術公開了一種人神經生長因子的重組變異體rhNGF及其制備方法。我們根據分子結構研究設計的人神經生長因子重組變異體(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG?10個氨基酸，多了GA二個氨基酸，此后從EFSV開始的序列同于人神經生長因子正常序列。采用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA，構建工程菌進行表達，得到rhNGF融合蛋白，用羥胺切割后進行純化即得到純化的rhNGF，其具有天然生物活性。
【技術實現步驟摘要】
人神經生長因子(hNGF)是人體中一種對神經修復機能有調節作用的生物活性因子，對促進神經系統的生長，損傷神經的再生具有決定性作用。目前hNGF作為藥品國內外均未上市，只有我國批準了鼠源NGF臨床應用，但鼠源NGF因種屬差異及病毒污染的威脅而終將被重組產品替代。用基因工程生產重組人神經生長因子是唯一的途徑。rhNGF具有重要臨床價值，將填補國際神經修復藥物的空白。我國每年有上百萬神經損傷病人，市場前景可觀。我們專利技術了一種通過蛋白質工程改造獲得的hNGF重組變異體及其制備方法。天然活性的人神經生長因子末端為 Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我們通過對其分子結構的深入研究,提出了 hNGF重組變異體的新結構，此重組變異體(rhNGF)的特征在于重組表達的hNGF肽段從N端第一個氨基酸開始少了 S絲氨酸、S絲氨酸、S絲氨酸、H組氨酸、P脯氨酸、I異亮氨酸、F苯丙氨酸、H組氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10個氨基酸，多了 G甘氨酸、A丙氨酸二個氨基酸，并從E谷氨酸、F苯丙氨酸、S絲氨酸、V纈氨酸及往后氨基酸開始符合hNGF正常序列，從總體分子量上看少 了 8個氨基酸。我們通過上述對hNGF進行的蛋白質工程改造以期獲得藥效更好、更穩定的hNGF重組突變體(rhNGF)，其為具有新結構的生物分子，以利于新藥開發和臨床應用。實例說明I.目的基因的獲得為了獲得人NGF重組變異體的cDNA，我們采用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA。全基因合成采用分段合成的方法進行。基因序列設計則根據我們的分子設計和參考文獻報道的hNGF的基因序列。我們設計的hNGF基因序列的5’端含有Kpnl酶切位點及編碼羥胺切割位點的序列，3’端含有Xbal酶切位點和終止密碼TGA。合成基因設計序列見圖I。圖I. rhNGF合成基因設計序列5’AAC GGC GCA GAA TTC TCG GTGTGT GAC AGT GTC AGC GTG TGG GTT GGGGAT AAG ACC ACC GCC ACA GAC ATC AAGGGC AAG GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAGGTG AAC ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAACAG TAC TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC GGG TGCCGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC TGG AACTCA TAT TGT ACC ACG ACT CAC ACC TTTGTC AAG GCG CTG ACC ATG GAT GGC AAGCAG GCT GCC TGG CGG TTT ATC CGG ATAGAT ACG GCC TGT GTG TGT GTG CTC AGCAGG AAG GCT GTG AGA TGA TCT AGA2.基因序列測定將人工合成的rhNGF的cDNA，插入載體pThioHis A，用合成的測序引物進行正向測序(測序儀ABI PRISM) ο將測序圖譜用計算機讀序，得到cDNA序列并翻譯成對應氨基酸，結果我們設計的hNGF的cDNA和氨基酸序列一致。表明我們克隆得到的rhNGF的cDNA是正確的。 3.表達質粒的構建將rhNGF的cDNA插入pBV220中直接表達，表達產物形成不溶性的包含體，需要經過變性和復性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三對二硫鍵，復性很困難，導致產率很低。為了獲得rhNGF的高效可溶性表達,我們把rhNGF與大腸桿菌硫氧還蛋白thioredoxin進行融合表達，thioredoxin可以引導其后的蛋白正確折疊，呈可溶性表達，具天然生物學活性，避免了變性復性的難題。切割方法用的是鹽酸羥胺切割法。鹽酸羥胺可以特異地切割蛋白中的Asn-Gly肽鍵，產生N端為Gly的多肽。我們發現rhNGF多肽中不含羥胺切割位點Asn-Gly，故我們選定輕胺切割位點Asn-Gly為連接點與thioredoxin融合表達rhNGF。表達的融合蛋白用輕胺切割后釋放出rhNGF，其起始氨基酸為Gly，此后的氨基酸序列與rhNGF序列一致。Gly與Met性質相似，放在N端均不影響蛋白的活性，況且hNGF的N端氨基酸對活性不重要，其N端8個氨基酸在人體內首先要被水解掉以實現功能。羥胺是人體內的正常代謝產物，鹽酸羥胺成本低，切割特異性好，切割效率高，適合工業化生產。我們選用質粒pThioHis A作為表達載體(Invitrogen公司產品)，它含有啟動子Ptrc promotor、thioredoxin前導肽及終止子aspA terminator,以及Amp抗性基因。我們將合成的rhNGF cDNA用Kpnl-Xbal雙酶切后的片段插入上述質粒的Kpnl-Xbal之間，構建成表達質粒pTHNGF。宿主菌選用大腸桿菌JM109 (購自Invitrogen公司)。大腸桿菌JM109的基因型為recAlsupE44 endAl hsdR17 gyrA96 relAl thi Δ (lac-proAB)F，。將質粒pTHNGF轉化入大腸桿菌JM109，即構成工程菌pTHNGF/JM109。將其保存于15%甘油中，冷凍于_70°C，即為原始種子庫。4. rhNGF工程菌的檢定4. I細菌形態、培養特征、生理生化特性從原始種子庫中取一支甘油保存的pTHNGF/JM109工程菌，接種在LBA培養基中，37°C搖蕩培養16小時，再以10%的比例接種到LBA培養基中(LB+0. lmg/ml Amp)，繼續培養3小時，以此為種子液進行以下各項檢查4. I. I細菌形態用種子液涂布玻片后，革蘭氏染色并鏡檢。工程菌為革蘭氏陰性，菌體為直桿狀，邊緣清晰，兩端鈍圓，大小基本一致，未見其它雜菌污染。4. I. 2培養特征用種子液劃線LBA平板，37°C培養20小時，肉眼可見菌落為圓形，邊緣光滑，菌落飽滿，表面濕潤、光滑，呈乳白色，基質未見色素產生。4. 1.3生理生化特性 能利用葡萄糖、乳糖、甘油作為碳源，不能利用果糖、肌醇。吲哚反應為陽性。V. P.反應呈陰性,不水解明膠。4. 2抗生素抗性特征未轉化的宿主菌BL21在LB培養基上生長，在LBA培養基上不生長(Amp :0. Img/ml) ο轉化后的工程菌pTHNGF/JM109在LB培養基和LBA培養基上都生長良好。表明工程菌pTHNGF/JM109具有氨芐青霉素的抗性。4. 3質粒酶切圖譜分析從上述種子液中提取質粒pTHNGF，進行酶切鑒定。用KpnI-XbaI及KpnI-PstI均可切出370bp的小帶,用EcoRI-PstI可切出約340bp的小帶,酶切鑒定結果均符合質粒設計，說明質粒PTHNGF構建正確。4. 4工程菌的表達與表達產物的獲得將pTHNGF/JM109種子液以I %的比例接種于LBA培養基中，37°C生長至OD6tltl約為O. 5，加入IPTG至ImM作為誘導劑，37°C誘導5小時，收獲菌體，洗滌后取樣裂解，進行SDS-PAGE電泳分析。可見誘導后的菌體在26kD處比空白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
本專利技術中的人神經生長因子重組變異體(rhNGF)特征在于表達的NGF肽段N端少了SSSHPIFHRG？10個氨基酸，多了GA二個氨基酸，分子量上看少了8個氨基酸，從EFSV開始同于人神經生長因子正常序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王革，
申請(專利權)人：王革，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。