從海藻提取物中純化巖藻依聚糖的工藝方法技術

本申請公開了從褐藻提取物中純化巖藻依聚糖的方法。具體地說，公開了純化提取物中的巖藻依聚糖以除去重金屬離子、細菌和內毒素污染物以及其他雜質的方法。所述方法應用了螯合劑、選擇性沉淀和過濾等手段。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術通常涉及巖藻依聚糖(本文也稱為AV513)的生產。更具體地說，本專利技術涉及純化巖藻依聚糖提取物以除去重金屬離子、細菌和內毒素污染物以及其他雜質但不影響期望的生物學活性的方法。
技術介紹
正常的凝血是一個復雜的生理和生化過程，其在幾個水平上受到調節。凝血過程涉及凝血因子級聯系統的激活，產生纖維蛋白和導致血小板聚集以及血管收縮(Davie等人的綜述，Biochemistry30 :10363，1991)。凝結級聯系統由“外源性”途徑和“內源性”途徑構成，外源性途徑被認為是引發正常凝血的主要手段，內源性途徑則擴展凝血反應。出血損害的正常反應包括激活外源性途徑。當血液接觸受傷后被暴露于組織上或在組織上表達的組織因子(TF)-因子VII的輔因子時，引發外源性途徑的激活。TF與促進產生FVIIa的FVII形成復合體。FVIIa接著結合TF將FX轉化為絲氨酸蛋白酶FXa，這是凝血酶原復合物的關鍵成分。通過FXa/FVa/鈣/磷脂復合物將凝血酶原轉化為凝血酶刺激了纖維蛋白的形成和血小板的活化，所有這些都是正常凝血所必需的。內源性的途徑因子IXa和VIIIa進一步增強正常的止血，這兩個因子也可以將FX轉化為FXa。也可以見Weitz，J. I.，等人，Chest, 126 (3)，September2004 (Suppl)，265S。硫酸多糖是一類動物和人類中以許多生物學活性為特征且具有良好耐受性的分子。這些聚陰離子分子通常來自植物和動物組織，并且包括廣范圍的亞類，包括肝素、葡糖氨基聚糖、巖藻依聚糖、交叉菜聚糖、多硫酸戍聚糖(pentosanpolysulfates)和硫酸皮膚素或硫酸葡聚糖。肝素樣的硫酸多糖顯示通過抗凝血酶III和/或肝素輔因子II相互作用介導的不同抗凝血活性(Toida TC, Linhardt, RJ.，Trends in Glycoscience andGlycotechnology2003 ； 15 :29-46)。盡管有這樣的一種硫酸多糖-口服肝素已被考慮作為一種抗凝血劑開發(ADunn，Idrugs, 3 =817-824, 2000)，但是只有肝素是不夠的，因為其具有嚴重的并發癥，這些并發癥包括術中和術后出血、骨質疏松、脫發、肝素抗性、肝素反跳、肝素誘導的血小板減少癥(HIT)、肝素誘導的血小板減少癥血栓形成綜合癥(HITTS)以及其他的缺點，包括中斷給藥幾天后抗凝血作用衰減(Iqbal O 等人，FareedJ, Expert Opin Emerg Drugs6 :111-135,2001 ；Roberts, HR, AnesthesiologylOO =722-730, 2004)。肝素通常胃腸外給藥，其口服吸收水平只有大約 I % (Fitton, J. H. , Glycoscience, The Nutrition Science Site,modified JanuaryOI,2005)。與肝素相反，另一種硫酸多糖，巖藻依聚糖，其從海藻分離出來，已經證明能夠調節(即加速)凝血(美國專利號2005/0282771)。具體地說，當在體外以低濃度給藥或在體內以低的皮下劑量給藥時，巖藻依聚糖通過外源性途徑途徑激活血友病情形下的凝血(Liu, T 等人，和 Johnson, K. ff.，Thrombosis andHaemostasis, 95 :68-76, 2006),這證實了其促凝血活性。更高劑量的巖藻依聚糖能夠具有與肝素相似的抗凝血活性。鑒于目前的抗凝血劑如肝素或芐丙酮香豆素(warfarin)的相關問題，因此明確地需要能夠克服與目前存在的抗凝血治療相關的一個或多個問題的藥物如巖藻依聚糖。由此，需要一種改進的方法，以經濟劃算和有效地生產具有最佳活性的富含巖藻依聚糖的提取物，用于促凝血劑或用于抗凝血治療應用。
技術實現思路
本專利技術基于從海藻提取物純化巖藻依聚糖的方法中獲得的發現。該方法提供高產率的巖藻依聚糖，該巖藻依聚糖基本不含有重金屬離子、細菌和內毒素污染物以及其他雜質。因此，本專利技術包括從非均相混合物富集巖藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供巖藻依聚糖源；(b)通過用螯合劑處理除去上述源中的重金屬離子，產生第一巖藻依聚糖混合物；(C)選擇性沉淀所述第一巖藻依聚糖混合物中的巖藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重懸含有巖藻依聚糖的沉淀物，獲得第二巖藻依聚糖混合物；(e)重復步驟(C)和(d) —次或多次；和(f)過濾包括巖藻依聚糖的水溶液，除去細菌和內毒素污染物，產生純化的巖藻依聚糖提取物。在一個實施方案中，所述巖藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一個實施方案中，巖藻依聚糖來自藻類。在一個優選的實施方案中，巖藻依聚糖來自墨角藻屬或昆布屬(Laminaria)。代表性的巖藻依聚糖來自墨角藻或海帶或其他來源,包括但不限于裙帶菜和泡葉藻。在一些實施方案中，螯合劑選自下組乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙-(β -氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA) ,2,3- 二巰基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3- 二巰基琥珀酸(DMSA)。在一個優選的實施方案中，螯合劑是EDTA。在一些實施方案中，螯合劑固定在固體載體上。在一個實施方案中，螯合劑是亞氨基二乙酸螯合樹脂。在一些實施方案中，用乙醇選擇性地沉淀巖藻依聚糖一次或多次，其中乙醇在巖藻依聚糖混合物中的濃度為約40%到50% (ν/ν)。在一些實施方案中，其pH保持在約5. 7到6. O之間。在一個優選的實施方案中，pH被調節到約5.95。在一些實施方案中，向巖藻依聚糖混合物中加入NaCl，濃度約為20-24g/升。在另一個方面中，本專利技術提供了包括巖藻依聚糖的組合物，巖藻依聚糖通過本文所述的方法產生。在一個實施方案中，巖藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一個實施方案中，巖藻依聚糖來自海藻。在一個優選的實施方案中，巖藻依聚糖來自墨角藻屬或昆布屬。代表性的巖藻依聚糖來自墨角藻或海帶或R村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡葉藻(Ascophyllumnodosum)、昆布(Ecklonia kurome)、鹿角藻(Pelvetia fastigiata)、單純性褐條藻(Saundersella simplex)、長松藻(Chordariaflagelliformis)或任何其他種類的含有巖藻依聚糖的海洋植物或動物。在優選的實施方案中，巖藻依聚糖具有生物學活性，例如具有促凝血活性。在一些實施方案中，所述組合物還可以包括藥學上可接受的賦形劑。在另一個方面，本專利技術提供了治療需要增強凝血的受治療者的方法，其包括向所述受治療者給予治療有效量的包括用本文所述的任何方法產生的巖藻依聚糖的組合物。在一些實施方案中，所述受治療者具有選自以下的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏導致的先天性凝血疾病和獲得性凝血疾病。在其它的實施方案中，需要凝血的原因是先前使用了抗凝血劑、手術或其 他侵入性的操作。在一些實施方案中，以約O. Olmg/kg到約I O O mg/kg的劑量給予巖藻依聚糖。本領域技術本文檔來自技高網...

【技術保護點】
從非均相混合物中純化巖藻依聚糖的方法，所述方法包括：(a)提供巖藻依聚糖源；(b)通過用螯合劑處理除去上述源中的重金屬離子，產生第一巖藻依聚糖混合物；(c)選擇性沉淀所述第一巖藻依聚糖混合物中的巖藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重懸含有巖藻依聚糖的沉淀物，獲得第二巖藻依聚糖混合物；(e)重復步驟(c)和(d)一次或多次；和(f)過濾含有巖藻依聚糖的水溶液，除去細菌和內毒素污染物，產生純化的巖藻依聚糖。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：帕特里克·N·嘉康利，詹尼弗·巴哈戴維森，斯里尼瓦莎·普拉薩德，科克·約翰遜，
申請(專利權)人：巴克斯特國際公司，巴克斯特健康護理股份有限公司，
類型：發明
國別省市：