一種納米介孔材料固定靶蛋白篩選中藥活性成分的方法技術

本發明專利技術涉及一種納米介孔材料固定靶蛋白篩選中藥活性成分的方法，介孔材料固定化蛋白，裝入色譜柱，制備固定化靶蛋白抑制劑篩選模型，將對靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制劑溶于緩沖液作為流動相，每隔固定的時間進樣飽和濃度的底物，收集出峰餾分，固定次數后將流動相換成不含抑制劑的緩沖液，每隔固定時間進樣飽和濃度的底物，收集出峰餾分，所述餾分分別冷凍干燥，溶于水，用分析型色譜柱分離底物和產物，紀錄產物的峰面積；繪制固定化靶蛋白抑制劑的抑制曲線，對模型進行驗證，再采用制備的模型將待篩選中藥水提物溶于緩沖液中作為流動相。根據產物的峰面積判斷中藥是否有抑制作用以及抑制的過程、類型。該方法具有可靠性高、在線等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種篩選中藥活性成分的方法，尤其涉及。
技術介紹
藥物篩選是現代藥物開發過程中測試和獲取特定生理活性化合物的一個步驟，是通過規范化的實驗手段從大量化合物或者新化合物中選擇對某一特定作用靶點具有較高活性的化合物的過程。藥物靶點包括基因位點、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子，近年的研究表明，酶作為藥物靶點具有很多優勢，且已獲得了很多重要的研究成果。但是，傳統利用靶蛋白為靶點進行中藥篩選，一般都采用將靶蛋白與底物/中藥水溶液混合孵育一段時間，利用紫外分光光度計測吸光值，從而進行抑制劑的篩選，這種方 法酶容易失活，而且篩選結果可靠度不高，且無法判斷抑制類型。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供，克服現有技術中采用將靶蛋白與底物/中藥水溶液混合孵育一段時間，再利用紫外分光光度計測吸光值，進行抑制劑的篩選，這種方法靶蛋白容易失活，且篩選結果可靠度不高，無法判斷抑制類型的缺陷。本專利技術解決上述技術問題的技術方案如下，包括以下步驟步驟A :制備固定化靶蛋白采用物理吸附法，將靶蛋白溶于的最適pH的緩沖液中，加入介孔材料，冰浴條件下攪拌孵育；步驟B :制備固定化靶蛋白抑制劑篩選模型以水為流動相，將步驟A所述固定化靶蛋白裝入色譜柱中，形成固定化靶蛋白抑制劑模型；步驟C :驗證步驟B制備的固定化靶蛋白抑制劑模型的有效果性；首先，選擇對靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制劑；再將步驟B制備的靶蛋白抑制劑模型連接液相色譜儀，將一定量的靶蛋白抑制劑溶于與步驟A中所述緩沖液pH相同的緩沖液中作為第一流動相；其次，開啟液相色譜儀，用所述第一流動相平衡柱子，每隔固定時間進樣靶靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數，收集不同時刻的出峰第一餾分；進樣靶靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數后，將所述的第一流動相換成不含固定化靶酶抑制劑的與步驟A中所述緩沖液PH相同的緩沖液，每隔固定時間進樣靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數，收集不同時刻的出峰第二餾分；最后，收集的不同時刻出峰第一餾分和不同時刻出峰第二餾分分別冷凍干燥，溶于水，用色譜柱分離底物和產物，紀錄不同時刻出峰第一餾分產物及不同時刻出峰第二餾分產物的峰面積。步驟D :重復步驟A和步驟B的步驟，將步驟B制備的固定化靶酶抑制劑模型連接液相色譜儀，將與步驟A中所述緩沖液pH相同的緩沖液中作為第二流動相；開啟液相色譜儀，用所述的第二流動相平衡柱子，固定時間進樣靶蛋白的飽和濃度的底物，收集不同時刻出峰第三餾分，將不同時刻的出峰第三餾分冷凍干燥，溶于水，用色譜柱分離底物和產物，紀錄的出峰第三餾分產物峰面積；所述出峰第三餾分產物為靶蛋白與底物未受抑制劑影響反應后的產物；步驟E :固定化靶蛋白抑制劑的抑制曲線以時間為橫坐標，以靶蛋白的殘余活力為縱坐標，制作隨時間改變，靶蛋白經歷活性被抑制和活性恢復的過程曲線；所述殘余活力為不同時刻的出峰第一餾分產物峰面積或不同時刻的出峰第二餾分產物峰面積與所述不同時刻的出峰第三餾分產物面積之比；步驟F :參照上述步驟A至步驟E中的方法，將方法中的固定化靶蛋白抑制劑換成天然藥物，篩選天然藥物中活性成分，考察其對靶蛋白的抑制作用及抑制類型。根據試驗數據繪制靶蛋白活性被抑制和活性恢復的過程曲線圖的可以得知，在該濃度下，抑制劑對靶蛋白的最大抑制率；同時根據最終靶蛋白活性恢復的結果，可以得知該抑制劑是可逆抑制劑還是不可逆抑制劑。本專利技術的有益效果是本專利技術利用具有無毒無害、孔徑可調、柱壓低等優勢的介孔材料固定化靶蛋白，裝入色譜柱，利用對靶蛋白具有代表性抑制作用的靶蛋白抑制劑對模型進行驗證后，在利用驗證模型的方法將天然產物溶于緩沖液中作為流動相，每隔固定的時間進樣飽和濃度的底物，收集出峰餾分，收集出峰餾分固定次數后將流動性換成不含天然產物的緩沖液，每隔固定的時間進樣飽和濃度的底物，收集出峰餾分。通過改變流動相使靶蛋白經歷抑制和活性恢復的過程。之后將收集的餾分用色譜柱分析，根據產物的峰面積判斷中藥是否有抑制作用以及抑制的類型。該方法具有可靠性高、在線等優點。在上述技術方案的基礎上，本專利技術還可以做如下改進。進一步，所述介孔材料為羧基或氨基修飾的有機介孔氧化硅材料。進一步，所述步驟A所述介孔材料通過以下步驟制備得到步驟Al :以三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(P123)為模板劑，1，3，5-三甲基苯(TMB)為擴孔劑，I, 2-雙-三乙氧基硅基乙烷(BTESE)為前導物，添加2-氰基丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅基乙烷的羧基或氨基偶聯劑；步驟A2 :調節P123和TMB的比例，制備羧基或氨基修飾的有機介孔氧化硅材料(-COOH-PMOs 或-NH2-PMOsX進一步,步驟Al所述三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯和1,3，5-三甲基苯的比例為4:0到4:4。進一步，步驟A2所述羧基或氨基修飾的有機介孔氧化硅材料的孔徑為8 30nm。進一步，步驟A所述冰浴條件下攪拌孵育時間為7小時。進一步，步驟C所述第一流動相平衡柱子15分鐘后，每隔固定時間為20分鐘進樣靶蛋白的飽和濃度的底物8至12次，收集不同時刻的出峰第一餾分。進一步，步驟C所述第一流動相換成不含固定化靶蛋白抑制劑的與步驟A中所述緩沖液PH相同的緩沖液，每隔固定時間為20分鐘進樣靶蛋白的飽和濃度的底物8至12次，收集不同時刻的出峰第二餾分。進一步，步驟C所述固定時間進樣的出峰第一餾分、出峰第二餾分及步驟D所述固定時間進樣的出峰第三餾分分別冷凍干燥后溶于300ul的水溶液中，再用C18分析型色譜柱分離底物和產物。以上步驟所述的靶蛋白可以為糖尿病、心血管疾病、腫瘤和病毒的靶蛋白。附圖說明圖I為本專利技術中制備的固定化酶模型篩選五倍子水提物抑制及酶活恢復過程曲線圖；圖2為本專利技術中制備的固定化酶模型篩選紅景天水溶性部位抑制及酶活恢復過程曲線圖；圖3為本專利技術中固定化 α -葡萄糖苷酶模型驗證過程采用6mM阿卡波糖抑制固定化α -葡萄糖苷酶及酶活恢復過程曲線圖；圖4為本專利技術中制備的固定化酶模型篩選麥冬水提物抑制及酶活恢復過程曲線圖；圖5為本專利技術中制備的固定化酶模型篩選射干水溶性部位抑制及酶活恢復過程曲線圖；圖6為中固定化醛糖還原酶模型驗證過程采用4mM依帕司抑制固定化醛糖還原酶及酶活恢復過程曲線圖。具體實施例方式以下結合附圖對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本專利技術，并非用于限定本專利技術的范圍。實施例I :以糖尿病靶酶α-葡萄糖苷酶為例，其底物為4-硝基苯-a-D-吡喃糖苷，典型的抑制劑為阿卡波糖。本實施例的具體過程和步驟如下I、介孔材料的制備用Ρ123為模板劑，TMB為擴孔劑，BTESE為前導物，CETES為-COOH偶聯劑，通過確定Ρ123/ΤΜΒ=4/3的比例，制備孔徑為13. 38nm的羧基化有機介孔氧化硅材料(-COOH-PMOs )；2、α -葡萄糖苷酶的固定利用物理吸附法，將α -葡萄糖苷酶溶于ρΗ4. 5的醋酸緩沖液，加入上述-COOH-PMOs材料，冰浴條件下攪拌孵育7h ；3、制備固定化α -葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型以水為流動相，用裝柱機將上述固定化α -葡萄糖苷酶裝入規格為4. 6*50mm的色譜柱中，于4°C保存；4、固定化α -葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型有效性驗證室溫下，ρΗ4. 5的醋酸緩本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種納米介孔材料固定靶蛋白篩選中藥活性成分的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟A：制備固定化靶蛋白：采用物理吸附法，將靶蛋白溶于的最適pH的緩沖液中，加入介孔材料，冰浴條件下攪拌孵育；步驟B：制備固定化靶蛋白抑制劑篩選模型：以水為流動相，將步驟A所述固定化靶蛋白裝入色譜柱中，構成固定化靶蛋白抑制劑篩選模型；步驟C：驗證步驟B制備的固定化靶蛋白抑制劑模型的有效果性；首先，選擇對靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制劑；再將步驟B制備的固定化靶蛋白抑制劑模型連接液相色譜儀，將一定量的固定化靶蛋白抑制劑溶于與步驟A中所述緩沖液pH相同的緩沖液中作為第一流動相；其次，開啟液相色譜儀，用所述第一流動相平衡柱子，每隔固定時間進樣靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數，收集不同時刻出峰第一餾分；進樣靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數后，將所述的第一流動相換成不含固定化靶蛋白抑制劑的與步驟A中所述緩沖液pH相同的緩沖液，每隔固定時間進樣靶蛋白的飽和濃度的底物固定次數，收集不同時刻出峰第二餾分；最后，收集的不同時刻出峰第一餾分和不同時刻出峰第二餾分分別冷凍干燥，溶于水，用分析型色譜柱分離底物和產物，紀錄不同時刻出峰第一餾分產物及不同時刻出峰第二餾分產物的峰面積。步驟D：重復步驟A和步驟B的步驟，將步驟B制備的固定化靶酶抑制劑模型連接液相色譜儀，將與步驟A中所述緩沖液pH相同的緩沖液中作為第二流動相；開啟液相色譜儀，用所述的第二流動相平衡柱子后，固定時間進樣靶蛋白的飽和濃度的底物，收集不同時刻出峰第三餾分，所述出峰第三餾分冷凍干燥，溶于水，用色譜柱分離底物和產物，紀錄不同時刻出峰第三餾分產物峰面積；步驟E：固定化靶蛋白抑制劑的抑制曲線：以時間為橫坐標，以靶蛋白的殘余活力為縱坐標，制作隨時間改變，靶蛋白經歷活性被抑制或激活和活性恢復的過程曲線；所述殘余活力為不同時刻出峰第一餾分產物峰面積或不同時刻出峰第二餾分產物峰面積與不同時刻出峰第三餾分產物峰面積之比；步驟F：參照上述步驟A至步驟E中的方法，將方法中的靶蛋白抑制劑換成天然藥物，篩選天然藥物中活性成分，考察其對靶蛋白的抑制作用及抑制類型。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴榮繼，王慧亨，顧昊，胡英慧，安靜，鄧玉林，孟薇薇，孟世英，王豐潮，
申請(專利權)人：北京理工大學，
類型：發明
國別省市：