本發明專利技術提供了用于制備高度純化的AAV載體制劑的方法。本文所述非常純的AAV制劑對于臨床用途較優。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生產質量管理規范和病毒載體純化的領域。更特別地，組合物和方法促進用于基因治療方案的高度純化的重組AAV的制備。
技術介紹
在本說明書各處引用若干出版物和專利文件以描述本專利技術所從屬的領域的狀態。這些引用各自通過引用如同全部陳述那樣結合于本文中?；蜻f送是用于獲得性疾病和遺傳性疾病的治療的充滿前景的方法。已描述了用于基因轉移目的的許多基于病毒的系統，包括基于腺相關病毒(AAV)的系統。AAV為屬于依賴病毒屬的依賴輔助病毒的DNA細小病毒。AAV需要與無關的輔助病毒(例如腺病毒、皰疫病毒或牛痘)共感染，以便發生生產性感染。在輔助病毒不存在的情況下，AAV通過將其基因組插入宿主細胞染色體中建立潛伏狀態。通過輔助病毒的隨后感染拯救整合的病毒基因組，其可接著復制以產生感染性的病毒子代。AAV具有廣泛的宿主范圍并且能夠在存在合適的輔助病毒下在來自任何物種的細胞中復制。例如，人AAV在與犬腺病毒共感染的犬細胞中復制。AAV不與任何人或動物的疾病相關并且當整合時似乎并不改變宿主細胞的生物學性質。對于AAV的綜述，參見例如 Berns 和 Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.)32:243-307。已描述了感染性重組AAV (rAAV)毒粒的構建。參見，例如，美國專利第5，173，414號和第5，139，941號；國際公布號WO 92/01070 (于1992年I月23日公布)和WO 93/03769(于 1993 年3 月 4 日公布)；Lebkowski 等· (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 ；Vincent 等.(1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter,B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 ；Muzyczka, N. (1992)Current Topics in Microbiol, and Tmmunol · 158:97-129 和 Kotin, R. M. (1994)Human Gene Trephy 5:793-801?？筛脑霢AV載體以通過全部或部分缺失AAV基因組的內在部分并將目標DNA序列插入ITR之間來攜帶異源的目標核苷酸序列(例如編碼治療蛋白的選定基因、反義核酸分子、核酶、miRNA等)。所述ITR在此類載體中仍有功能，允許包含異源的目標核苷酸序列的rAAV的復制和包裝。所述異源的核苷酸序列還典型地與能夠在某些條件下在患者的靶細胞中驅動基因表達的啟動子序列連接。終止信號，例如聚腺苷酸化位點，也可包含于所述載體中。雖然完全消除病毒載體的免疫原性并非現實的目標，但將制備用于人基因治療的AAV載體的免疫原性最小化是高度所需的。本專利技術的一個目標是提供實現該目標的組合物和方法。專利技術簡述 依照本專利技術，提供了用于從包含AAV載體顆粒、空衣殼和宿主細胞雜質的AAV制備物中純化包含編碼治療蛋白或其片段的轉基因的真正的AAV載體顆粒，從而提供基本不含AAV空衣殼的AAV產物的方法。示例性純化方案包括收獲轉導了 AAV的細胞；經由切向流過濾濃縮所述細胞；以及通過微射流裂解所述細胞以形成裂解液。接著將裂解液過濾并澄清。澄清后，AAV顆粒通過離子交換柱層析法純化并任選通過切向流過濾進一步濃縮。接著將如 此產生的洗脫液在等密度梯度上分層并進行超速離心，收獲包含病毒顆粒的層并通過切向流過濾進行緩沖液交換。接著純化的AAV顆粒用表面活性劑配制，并將所得制劑過濾以移除任何殘留雜質，從而產生高度純化的AAV產物，其中所述真正的AAV載體顆粒在所述AAV產物中以至少95%的量，優選大于98%的量存在。在一個優選的實施方案中，AAV產物包含IO15個顆粒/mL濃度的AAV顆粒，更優選顆粒以IO16個顆粒/mL濃度存在并且最優選，顆粒以IO17個顆粒/mL濃度存在。如此純化的AAV載體可為多種血清型的，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。在又一個實施方案中，公開了一種AAV載體制劑，其在藥學上可接受的載體中包含使用上述方法純化的AAV顆粒。本專利技術的純化的AAV顆粒包含編碼所需基因產物的異源核酸。此類產物包括但不限于SiRNA、反義分子、miRNA、核酶等。其它產物包括編碼可用于修正先天性代謝缺陷的激素、生長受體、配體和蛋白的核酸。在特別優選的實施方案中，載體編碼選自RPE65、因子VIII和因子IX的蛋白。附圖簡述 圖I.重組AAV產生期間產生的AAV顆粒的類型的圖解，包括使用當前工業標準的可擴縮純化工藝達到的純化(真正的載體和載體相關雜質的混合物)，和使用我們的可擴縮純化方法達到的純化(載體相關雜質的基本移除)的示意圖，我們的可擴縮純化方法摻有梯度超速離心步驟，根據所用純化步驟的順序使所述梯度超速離心步驟“可擴縮”。圖2.顯示本專利技術的載體純化工藝步驟的流程圖。圖3.通過梯度超速離心的代表性工業標準可擴縮純化工藝(genl-Chr)-純化的AAV載體的分析。顯示了表面上‘純的’載體中的AAV顆粒的相對量和異質性，以及在真正的AAV載體自載體相關雜質的分離中梯度超速離心的有效性?！甮enl-Chr’代表了當前“工業標準”可擴縮純化工藝。專利技術詳述 本專利技術提供了一種AAV載體純化平臺，其包含兩個將其與當前‘工業標準’的可擴縮AAV載體純化工藝區別的獨特特征1)提供高的載體純度的可用于不同AAV血清型/衣殼變體的純化的模塊化平臺方法，所述方法包括載體相關雜質的有效移除；和2)方法步驟的獨特順序(包括柱層析法、之后的切向流過濾和接著的梯度超速離心的關鍵‘核心’順序)，其賦予對重要的超速離心步驟的意外的可擴縮性。AAV載體產生和純化方法的最優化確保了載體產物可有效地將其遺傳有效負載遞送至靶細胞，并使有害的免疫應答的激活的可能性最小化。由于載體相關雜質對于預期的人受者是非自身且免疫刺激的，其應在人胃腸外產品的純化期間最小化或消除。載體相關雜質在細胞培養中的載體產生期間典型地以比真正的載體高得多的量產生，并且由于它們結構相似在純化期間難以與載體分離。在載體產生后的粗制細胞收獲物中，載體相關雜質通常占>50%，典型地約80%，并且可占生物合成的總AAV顆粒的>80%。這在使用迄今為止開發用于產生AAV載體的各細胞培養系統中已觀察到。純化作為治療人類疾病的產品的重組AAV的生產方法的開發必須實現以下目標I) 一致的載體純度、效價和安全性；2)生產方法的可擴縮性；和3)生產的可接受成本。當前‘工業標準’的可擴縮AAV載體純化工藝并不足以實現載體相關雜質的移除，其對于滿足以上列出的第一目標(一致的載體純度、效價和安全性)是重要的。此外，已出現使用當前工業標準的可擴縮純化工藝不能充分地移除載體相關雜質的情況，這是由于1)用于除疫苗(其中通常尋求而非避免免疫應答)之外的應用的病毒產物(例如重組AAV)的純化工藝的開發是相對不成熟的；2)涉及用于AAV載體的可擴縮純化工藝的開發的許多本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.01.28 US 61/299,1841.一種用于從包含AAV載體顆粒、空衣殼和宿主細胞雜質的AAV制備物中純化包含編碼治療蛋白或其片段的轉基因的真正的AAV載體顆粒，從而提供基本不含AAV空衣殼的AAV產物的方法，所述方法包括 a)收獲包含重組AAV的細胞； b)經由切向流過濾濃縮所述細胞； c)通過微射流裂解所述細胞以形成裂解液； d)過濾，從而使步驟c)的裂解液澄清； e)通過離子交換柱層析法純化AAV顆粒并任選通過切向流過濾濃縮柱洗脫液； f)混合所述洗脫液和氯化銫并將所述混合物進行離心； g)在步驟f)之后收集病毒顆粒并通過切向流過濾進行相同的緩沖液交換； h)用表面活性劑配制純化的AAV顆粒以提供AAV顆粒制劑； i)過濾所述制劑以移除任何殘留的雜質，其中所述AAV產物中存在的所述真正的AAV載體顆粒的量為至少95%。2.權利要求I的方法，其中所述AAV載體顆粒以100mg/mL的濃度存在。3.權利要求I的方法，其中步驟i)的所述AAV顆粒以IO15個顆粒/mL的濃度存在。4.權利要求I的方法，其中步驟i)的所述AAV顆粒以IO16個顆粒/mL的濃度存在。5.權利要求I的方法，其中步驟i)的所述AAV顆粒以IO17個顆粒/mL的濃度存在。6.權利要求I的方法，其中所述AAV載體顆粒來源于選自以下的AAVAAVU AAV2、AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。7.—種AAV載體制劑，其在藥學上可接受的載體中包含使用權利要求I的方法純化的AAV顆粒。8.權利要求I的方法，其中所述轉基因編碼選自以下的核酸SiRNA、反義分子、miRNA、核酶和 shRNA。9.權利要求I的方法，其中所述轉基因編碼選自以下的基因產物胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、制管張素、粒細胞集落刺激...
【專利技術屬性】
技術研發人員：JF賴特，G屈，B豪克，K海，
申請(專利權)人：費城兒童醫院，
類型：
國別省市：
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