本發明專利技術公開了一種人胚胎干細胞定向分化為角膜內皮細胞的誘導方法：在小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上培養人胚胎干細胞，分選狀態良好的人胚胎干細胞克隆團，接種于經絲裂霉素C處理過的人角膜基質成纖維細胞層上，培養7天，人胚胎干細胞分化成菊形團，將菊形團從人角膜基質成纖維細胞層分離移至培養瓶內，采用神經嵴干細胞培養基繼續培養7天，流式細胞儀分選出人神經嵴干細胞，加入培養瓶內，采用人角膜內皮細胞條件培養基置于37℃、5%CO2孵箱內孵育培養，隔天換液，培養10天左右，即得角膜內皮細胞，其增殖能力類似正常人角膜內皮細胞,體外最多能傳1～2代，可以作為種子細胞用于組織工程角膜構建及移植。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種，以及利用該誘導方法得到的角膜內皮細胞作為種子細胞用于組織工程角膜構建及內皮移植的用途，屬于組織工程及眼科領域。
技術介紹
角膜內皮細胞位于角膜最內層呈六邊形結構單層排列，對于維持角膜透明及其正常生理功能具有十分重要的意義。人角膜內皮細胞缺乏增殖能力，受損后主要依賴損傷區周邊細胞的擴展和移行進行修復，當細胞密度小于500-800個/mm2時則會引起角膜內皮功能失代償，導致角膜持續水腫失去透明性，表現為大泡性角膜病變，患者視力受損并出現眼磨、畏光、流淚等不適癥狀。感染、炎癥、外傷(機械傷、化學傷、產傷、激光射線等)、眼部手術(白內障手術，抗青光眼手術，及其他眼內操作如前房異物取出等)、遺傳性疾病、代謝性疾 病等都可引起內皮細胞損傷，受損到一定程度導致大泡性角膜病變，此時恢復視力、改善癥狀的唯一有效途徑是角膜移植。但是角膜供體來源匱乏是全世界面臨的難題，極大地限制了角膜移植手術的開展，使眾多角膜病患者不能得到及時醫治，只能在痛苦中等待角膜材料，帶來極大的社會負擔。近年來，隨著國家復明工程的推進以及各地區醫療水平的不斷提高，白內障、抗青光眼等手術得以廣泛開展，隨之而來的術中內皮受損，術后內皮細胞功能失代償問題日顯嚴峻。因此，體外獲得大量具有正常功能的人角膜內皮細胞用于臨床替代病變受損的角膜內皮具有重要的臨床實踐意義。人們一直致力于探索體外大規模擴增人角膜內皮細胞的方法。早期研究人員利用血管內皮細胞替代人角膜內皮細胞，能夠在一定時間內維持角膜透明性，但要長期保持角膜透明及其生物安全性需要進一步實驗驗證。隨著研究深入，人們嘗試誘導前體細胞或祖細胞向人角膜內皮樣細胞分化，比如人臍靜脈內皮細胞具有祖細胞特性，將其移植到眼內在角膜基質和房水微環境的誘導下，細胞形態發生內皮樣變化，同時角膜水腫減輕，表明其具有一定的內皮泵功能。有報道利用共培養的方法將骨髓內皮祖細胞誘導分化為角膜內皮樣細胞，誘導細胞移植后角膜部分恢復透明。此外，近年來多個實驗室研究發現在角膜基質、周邊部內皮、小梁網以及過渡區內存在角膜內皮前體細胞，如能將這些細胞分離提純，將為角膜內皮細胞體外誘導提供新的細胞來源。雖然人們進行了大量實驗研究，期望實現人角膜內皮細胞的體外大規模擴增，但目前人們仍未找到體外獲取具有正常功能的人角膜內皮細胞的方法。追溯人體發育過程，所有的體細胞均來源于胚胎干細胞。1998年人們成功實現了胚胎干細胞的分離培養。胚胎干細胞作為全能干細胞具有強大自我更新能力和分化能力，理論上可以分化為所有類型的成體細胞。目前已有報道成功誘導人胚胎干細胞分化為神經嵴干細胞、間充質干細胞以及脂肪細胞、神經元細胞和成骨細胞等終末分化細胞。人胚胎發育過程中，角膜內皮細胞來源于神經嵴干細胞，目前人們原代培養鼠神經嵴干細胞通過一定誘導條件使其分化為鼠角膜內皮細胞。涉及到倫理學爭議，我們尚無法通過原代培養的方法獲取人神經嵴干細胞，從而阻礙了人角膜內皮細胞的誘導分化。因此，我們期望誘導人胚胎干細胞分化為人神經嵴干細胞。有研究表明，將人胚胎干細胞與胚胎鼠顱骨基質細胞(PA6)共培養，利用基質細胞的誘導活性成功誘導出人神經嵴干細胞；角膜基質細胞具有很強的增殖能力在體外可以大量擴增。
技術實現思路
針對上述現有技術，基于現有技術中的研究，本專利技術提供了一種。本專利技術利用人角膜基質細胞誘導人胚胎干細胞轉化為神經嵴干細胞，從而避免了動物細胞成分的污染，提高了生物安全性；再將誘導分化得到的人神經嵴干細胞進一步誘導轉變為人角膜內皮細胞。該過程模擬人角膜內皮細胞胚胎發育，誘導出的細胞理論上最接近正常人角膜內皮細胞。本專利技術還將誘導分化人胚胎干細胞獲得的人角膜內皮細胞應用于角膜內皮功能失代償動物模型，為進一步臨床應用奠定了基礎。本專利技術是通過以下技術方案實現的·一種，步驟如下(I)人角膜基質成纖維細胞的原代培養將不適合用于角膜移植的新鮮人角膜環浸于含100U/ml青霉素-100U/ml鏈霉素的平衡鹽溶液沖洗消毒,置于倒置顯微鏡下,上皮刀刮除角膜上皮，顯微鑷子撕除后彈力層及內皮，剩余角膜基質用顯微剪剪成ImmX Imm組織塊，均勻貼壁于培養皿，待貼壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37°C、5%C02孵箱內孵育培養，每3天更換一次培養基；培養7天發現部分基質細胞游出，10天左右，剔除組織塊，繼續培養7天，倒置顯微鏡下觀察待細胞鋪滿培養皿底部70% 80%時I :2傳代培養；傳代培養至第四代，加入上述培養基及絲裂霉素C(加入后，絲裂霉素C的終濃度為10ug/ml，絲裂霉素C可隨培養基一起加入，也可單獨加入)，抑制2小時，獲得人角膜基質成纖維細胞層；所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基是在普通的DMEM/F12培養基基礎上添加胎牛血清制成的，添加后，胎牛血清占總液體量的10% (在本專利申請中，如無特別說明，溶液百分比均表示添加物在終溶液中的體積分數);(2)常規原代培養小鼠胚胎成纖維細胞，取其3 4代作為飼養層，采用人胚胎干細胞培養基常規培養人胚胎干細胞，機械法分選形態狀態良好的人胚胎干細胞克隆團，按照8 12個克隆/cm2密度接種于步驟(I)制備的人角膜基質成纖維細胞層上，采用不含bFGF的人胚胎干細胞培養基(在不含bFGF的培養環境下，有利于人胚胎干細胞進一步分化)培養7天，人胚胎干細胞分化成菊形團，機械法將菊形團從人角膜基質成纖維細胞層分離移至lOug/ml纖維連接蛋白包被的培養瓶內，采用神經嵴干細胞培養基繼續培養7天，流式細胞儀分選出P75(+)細胞(人神經嵴干細胞)；所述人胚胎干細胞培養基是在DMEM knock out基礎培養基上添加以下物質制成的knock out血清替代物,巰基乙醇,谷氨酰胺，非必需氨基酸(購自美國Invitrogen公司，貨號11140)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF);添加后，knock out血清替代物占總液體量的20% (體積分數)，巰基乙醇的濃度為0. ImM，谷氨酰胺的濃度為0. ImM，非必需氨基酸的濃度為0. ImM，堿性成纖維細胞生長因子的濃度為4ng/ml ；所述不含bFGF的人胚胎干細胞培養基是指未添加bFGF的人胚胎干細胞培養基(其它成分如上述);所述形態狀態良好的人胚胎干細胞是指圓形或類圓形、邊緣光滑、細胞排列緊密均質、未分化的人胚胎干細胞；所述神經嵴干細胞培養基是在DMEM/F12培養基上添加以下物質制成的B27，ITS, EGF, bFGF和NGF ;添加后各物質的終濃度分別為B27占總液體量的2%，ITS占總液體量的 l%，EGF20ng/ml，bF GF 10ng/ml, NGF 10ng/ml ；(3)人神經嵴干細胞誘導分化為人角膜內皮細胞將步驟(2)分選出的人神經嵴干細胞用人角膜內皮細胞條件培養基重懸，加入經10ug/ml層粘連蛋白/10ug/ml硫酸軟骨素包被的培養瓶內，置于37°C、5%C02孵箱孵育培養，隔天更換人角膜內皮細胞條件培養基，倒置顯微鏡下觀察細胞形態由梭形逐漸變為多邊形，至10天左右細胞基本長滿，互相間形成緊密連接呈多邊形單層排列，體外光學顯微鏡觀察、實時定量聚合酶鏈式反應、免疫熒光等證實誘導細胞具有與正常人角膜內皮細胞相似的形態和表型，誘導出本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人胚胎干細胞定向分化為角膜內皮細胞的誘導方法，其特征在于：步驟如下：（1）人角膜基質成纖維細胞的原代培養：將新鮮人角膜環浸于含100U/ml青霉素?100U/ml鏈霉素的平衡鹽溶液沖洗消毒，置于倒置顯微鏡下，上皮刀刮除角膜上皮，顯微鑷子撕除后彈力層及內皮，剩余角膜基質用顯微剪剪成1mm×1mm組織塊，均勻貼壁于培養皿，待貼壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO2孵箱內孵育培養，每3天更換一次培養基；待細胞鋪滿培養皿底部70%～80%時1：2傳代培養；傳代培養至第四代，加入上述培養基及絲裂霉素C，抑制2小時，獲得人角膜基質成纖維細胞層；（2）常規原代培養小鼠胚胎成纖維細胞，取其3～4代作為飼養層，采用人胚胎干細胞培養基常規培養人胚胎干細胞，機械法分選形態狀態良好的人胚胎干細胞克隆團，按照8～12個克隆/cm2密度接種于步驟（1）制備的人角膜基質成纖維細胞層上，采用不含bFGF的人胚胎干細胞培養基培養7天，人胚胎干細胞分化成菊形團，機械法將菊形團從人角膜基質成纖維細胞層分離移至10ug/ml纖維連接蛋白包被的培養瓶內，采用神經嵴干細胞培養基繼續培養7天，流式細胞儀分選出人神經嵴干細胞；（3）人神經嵴干細胞誘導分化為人角膜內皮細胞：將步驟（2）分選出的人神經嵴干細胞用人角膜內皮細胞條件培養基重懸，加入經10ug/ml層粘連蛋白/10ug/ml硫酸軟骨素包被的培養瓶內，置于37℃、5%CO2孵箱孵育培養，隔天更換人角膜內皮細胞條件培養基，培養至細胞基本長滿，互相間形成緊密連接呈多邊形單層排列，即得人角膜內皮細胞。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳欣怡，張凱，陳紅梅，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：
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