轉基因大豆品系RRS PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種轉基因大豆品系RRS?PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用于PCR擴增以及DHPLC分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因大豆品系RRS檢測方法。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個堿基，分辨率高。本發明專利技術的引物和檢測方法為轉基因大豆品系RRS檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種轉基因產品 的檢測，特別是涉及一種轉基因大豆品系的PCR-DHPLC檢測弓I物及檢測方法。
技術介紹
目前，全球轉基因作物種植面積正迅猛增長。轉基因大豆依然是最主要的轉基因作物，種植面積占全球轉基因作物總種植面積的一半以上。我國近年進口大豆的數量逐年增加。隨著轉基因作物種植面積的不斷擴大，轉基因作物及其食品的環境釋放安全性及食用安全性也受到越來越廣泛的關注。我國政府于2002年實施的《農業轉基因生物安全評價管理辦法》、《農業轉基因生物進口安全管理辦法》、《農業轉基因生物標識管理辦法》列出了第一批標識管理的轉基因食品，轉基因大豆名列首位。面對如此大批量的進口大豆，更需要快速、簡便、可靠的轉基因檢測技術。目前的檢測方法中以常規PCR、實時熒光PCR等最為方便快捷。但是對于常規PCR，其檢測結果分析通常采用電泳分析，最常見的即凝膠電泳分析，這種分析方法分辨率不高，操作繁瑣，需要制膠、點樣、電泳、照相等，并且這些過程目前都無法實現自動化操作，工作量大。而實時熒光PCR由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展。變性高效液相色譜分析檢測(DenaturingHigh-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一種特異性強、分辨率高、重復性好、擴展性能好的分析檢測方法。該方法可一次同時分析多個樣品，對滿足口岸檢疫工作需要、提升轉基因產品的檢測水平，加強我國對進境植物及其產品中轉基因成分的檢疫監管、保護我國作物的生產安全具有重要意義。目前，尚沒有轉基因大豆品系RRS的PCR結合DHPLC檢測技術(PCR-DHPLC)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于轉基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC檢測的引物。本專利技術的另一目的是提供一種基于上述引物的擴展性能好、靈敏度和分辨率高的轉基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采用了以下技術方案本專利技術公開了用于轉基因大豆品系RRS PCR-DHPLC檢測的引物，所述引物包括引物對2，引物對2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT-3，。進一步的，所述引物還包括引物對1，引物對I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5，-TCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3，Seq ID No. 2 :5’ -GGTTTTGGGGTGCCGTTT-3’。更進一步的，所述引物對I的上游引物5’端還包括Seq ID No. 5所示序列，下游引物5’端還包括Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 6 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6是分別在上游引物和下游引物的5’端添加的與檢測靶標序列無關的兩段序列，該兩段序列可以是與檢測靶標序列同源性很遠的其它物種的序列，也可以是隨機生成的序列。該兩段序列作為調控序列，可以用于控制PCR擴增產物的大小，以便于PCR擴增產物的進一步分析。 本專利技術中，優選的，所述引物對I的上游引物具有Seq ID No.7所示序列，下游引物具有Seq ID No. 8所示序列；引物對2的上游引物具有Seq ID No. 3所示序列，下游引物具有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 7 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3’Seq ID No. 8 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTTTTGGGGTGCCGTTT-3，。需要說明的是，所述Seq ID No. 7和Seq ID No. 8序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分別在其5’端添加調控序列而成,所述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4序列的5’端前20個堿基也是調控序列。盡管上述已經說明Seq ID No. 5和Seq ID No. 6所示調控序列可以是隨機生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本專利技術中，需要考慮調控序列與設計的特異性位點序列理化性質的統一協調，并且還需要考慮添加調控序列后的引物作為檢測引物的整體性能。本專利技術中，更優選的，所述引物對I為檢測大豆內源基因Lectin基因的引物，引物對2為檢測轉基因大豆品系RRS的引物。本專利技術還公開了一種用于轉基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括采用上述的引物對I和2中的至少一對引物，以大豆DNA為模板進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行變性高效液相色譜分析。進一步的,所述檢測方法還包括以marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。優選的上述檢測方法包括如下步驟(A)采用所述引物，以大豆DNA為模板，進行PCR擴增；(B)以步驟(A)的PCR擴增產物為樣品進行DHPLC分析，同時以marker為參考標準進行DHPLC分析；(C)將步驟⑶中樣品的DHPLC分析結果與marker的DHPLC分析結果進行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測的靶標序列。由于采用以上技術方案，本專利技術的有益效果在于本專利技術的轉基因大豆RRS品系檢測引物具有較強的特異性，能夠用于后續的PCR擴增以及DHPLC分析。本專利技術將PCR與DHPLC相結合，提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因大豆品系RRS檢測方法，能夠實現轉基因大豆品系RRS的多靶標檢測。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，對不同大小的PCR產物片段區分率可達數個堿基，分辨率高。本專利技術的引物和檢測方法為轉基因大豆品系RRS檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測方法，特別適合用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。附圖說明圖I至圖3為本專利技術實施例中DHPLC分析的部分結果，其中I為非轉基因大豆、2為轉基因大豆256043、3為轉基因大豆A2704-12、4為轉基因大豆305423、5為轉基因大豆M0N89788、6為轉基因大豆A5547_127、7為轉基因大豆RRS品系GTS-4_3-2、9_12為陰性對照，分別為玉米、油菜、水稻、棉花的DNA ；marker-puc為puc18marker,marker的各峰值從左至右依次為 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。 具體實施例方式本專利技術公布了用于轉基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC檢測的引物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于轉基因大豆品系RRS?PCR?DHPLC檢測的引物，其特征在于：所述引物包括引物對2，引物對2的上游引物含有Seq?ID?No.3所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.4所示序列；Seq?ID?No.3：5’?CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT?3’Seq?ID?No.4：5’?CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT?3’。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：章桂明，向才玉，凌杏園，潘廣，程穎慧，康林，李鶴遙，
申請(專利權)人：深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：