用于基因轉移的方法技術

本發(fā)明專利技術公開的是使用逆轉錄病毒載體用于將基因引入靶細胞內的方法，其是簡單和高度有效的。具體公開的是使用逆轉錄病毒載體用于將基因引入靶細胞內的方法，其包括步驟（a）將含有逆轉錄病毒載體（在其上具有攜帶的外源基因）的液體置于在其上已固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器內，并且在低于25℃的溫度溫育液體4小時或更久，從而產(chǎn)生具有與之結合的逆轉錄病毒載體的培養(yǎng)容器，和（b）將靶細胞加入已在步驟（a）中產(chǎn)生的培養(yǎng)容器內，并且溫育培養(yǎng)容器。該基因引入方法是簡單和高度有效的，并且在醫(yī)學、細胞技術、基因技術、發(fā)育技術等領域中是特別有用的。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用逆轉錄病毒載體用于將外源基因轉移到靶細胞內的方法。
技術介紹
近來，用于治療嚴重遺傳疾病、癌癥等的基因療法已得到開發(fā)。已檢查對于人的臨床應用的大多數(shù)基因療法迄今為止涉及使用重組逆轉錄病毒載體將基因轉移到細胞內。逆轉錄病毒載體可以將目的外源基因穩(wěn)定整合到靶細胞的染色體DNA內。因此，通過逆轉錄病毒載體的基因轉移是特別用于其中希望長期基因表達的基因療法的基因轉移的優(yōu)選方式。 已報道使用逆轉錄病毒載體的基因轉移效率通過使用細胞粘合物質得到增加，所述細胞粘合物質結合逆轉錄病毒，例如纖連蛋白或纖連蛋白片段CH-296 (例如專利文獻I)。此外，已報道基因轉移效率通過這樣的方法進一步增加，所述方法包括將含有逆轉錄病毒載體的溶液加入用RetroNectin (注冊商標)包被的容器，隨后溫育一定時間段以僅允許病毒載體結合在RetroNectin (注冊商標)上，去除含有針對感染的抑制物質的上清液，并且隨后加入祀細胞(RetroNectin Bound Virus Infection方法RBV方法)(專利文獻2，非專利文獻I)。在RBV方法中病毒載體與RetroNectin (注冊商標)的結合可以通過利用離心力(離心RBV方法)得到增強。然而，離心RBV方法需要可以忍受離心力的容器和用于離心操作的昂貴儀器，并且該操作包括多步。此外，還存在當需要基因轉移到大量細胞內時，難以按比例擴大處理能力的問題。引用列表 專利文獻 專利文獻I W0 95/26200 專利文獻2 W0 00/01836 非專利文獻 非專利文獻 I J. Biochem.，第 130 卷，第 331-334 頁(2001)。專利技術概述 技術問題 本專利技術的目的是提供使用逆轉錄病毒載體用于將基因轉移到靶細胞內的方便和有效方法。問題的解決方案 具體地，本專利技術涉及 使用逆轉錄病毒載體將外源基因轉移到靶細胞內的方法，該方法包括下述步驟(a)和(b) (a)將含有攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體的液體置于在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器中，隨后在小于25°C的溫度溫育4小時或更久，以獲得逆轉錄病毒載體與之結合的培養(yǎng)容器；和 (b)將靶細胞加入通過步驟(a)獲得的培養(yǎng)容器內，隨后溫育； 根據(jù)項目的方法，其中在步驟(a)中的溫育時間是超過5小時且不超過48小時； 根據(jù)項目的方法，其中在步驟(a)中的溫育是伴隨振蕩的溫育； 根據(jù)項目用于轉移基因的方法，其包含下述步驟(a)至(b2): (a)將含有攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體的液體置于在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器內，隨后在小于25°C的溫度溫育4小時或更久，以獲得逆轉錄病毒載體與之結合的培養(yǎng)容器； (bl)洗滌通過步驟(a)獲得的培養(yǎng)容器；和 (b2)將靶細胞加入在步驟(bl)洗滌的培養(yǎng)容器內，隨后溫育； 根據(jù)項目的方法，其中逆轉錄病毒結合物質是選自下述的至少一種纖連蛋白、成纖維細胞生長因子、膠原V型、聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖、及其片段； 根據(jù)項目的方法，其中逆轉錄病毒結合物質還具有細胞結合活性； 根據(jù)項目的方法，其中在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器是在其上固定逆轉錄病毒結合物質和細胞結合物質的培養(yǎng)容器；和 根據(jù)項目的方法，其中具有的細胞結合物質是選自下述中的至少一種細胞粘附蛋白質、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。專利技術的有利效應 根據(jù)本專利技術，提供了方便和有效的基因轉移方法。用于實施本專利技術的方式 本專利技術的基因轉移方法包括步驟(a) “將含有攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體的液體置于在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器中，隨后在小于25°C的溫度溫育4小時或更久，以獲得逆轉錄病毒載體與之結合的培養(yǎng)容器”;和步驟(b) “將靶細胞加入通過步驟Ca)獲得的培養(yǎng)容器內，隨后溫育”。如本文使用的逆轉錄病毒共同意指屬于逆轉錄病毒科的RNA病毒，所述逆轉錄病毒科的基因組由RNA組成且在受感染細胞中具有將RNA轉換為DNA的生命周期，并且包括致癌逆轉錄病毒(oncoretroviruses)和慢病毒。致癌逆轉錄病毒的例子包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)0如本文使用的，逆轉錄病毒載體指通過重組DNA技術在逆轉錄病毒例如致癌逆轉錄病毒或慢病毒的基礎上產(chǎn)生的病毒顆粒，并且包括致癌逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及其假型載體。致癌逆轉錄病毒載體的例子包括基于MMLV的載體。慢病毒載體的例子包括基于HIV-I的載體和基于SIV的載體。假型載體指具有衍生自不同于Gag和Pol蛋白質起源的病毒的Env蛋白質的重組逆轉錄病毒載體。假型載體的例子包括具有衍生自下述等的Env蛋白質的致癌逆轉錄病毒和慢病毒載體水泡性口炎病毒(VSV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓內源病毒RD114、鼠白血病病毒(親嗜性-env、雙嗜性-env、10Al-env等)。在本專利技術中，優(yōu)選使用復制缺陷型重組逆轉錄病毒載體。消除復制缺陷型重組逆轉錄病毒載體的復制能力，從而使得載體不能在受感染細胞中自主復制，并且因此載體是非致病性的。載體可以感染宿主細胞例如脊椎動物細胞，特別是哺乳動物細胞，且將由載體攜帶的外源基因穩(wěn)定整合到宿主細胞的染色體DNA內。在步驟(a) “將含有攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體的液體置于在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器中，隨后在小于25°C的溫度溫育4小時或更久，以獲得逆轉錄病毒載體與之結合的培養(yǎng)容器”中使用的含有逆轉錄病毒載體的液體并無具體限制，并且其例子包括含有逆轉錄病毒載體的病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)上清液。在步驟(a)中，在將含有攜帶外源基因的逆轉錄病毒載體的液體置于在其上固定逆轉錄病毒結合物質的培養(yǎng)容器中之后，可以將所述含有液體的培養(yǎng)容器冷凍且貯存一定時期。在這種情況下，可以對已冷凍且貯存的具有含有逆轉錄病毒載體的液體的培養(yǎng)容器直接實施在小于25°C的溫度4小時或更久的溫育。即，用于解凍的另外步驟不是特別要求的。在這種情況下，希望在步驟(a)中的溫育可以是伴隨振蕩的溫育。用于產(chǎn)生逆轉錄病毒載體的一般過程的例子包括包含將攜帶外源基因和包裝信號的轉移載體引入逆轉錄病毒包裝細 胞內的過程，其中編碼逆轉錄病毒結構蛋白質的基因例如gag-pol基因和env基因先前整合到其染色體內，和包含用上述轉移載體和具有編碼逆轉錄病毒結構蛋白質例如gag-pol基因和env基因的包裝質粒共轉染不含逆轉錄病毒結構蛋白質的細胞的過程。在合適啟動子例如逆轉錄病毒載體中存在的LTR啟動子或外源啟動子的控制下，可以通過由重組逆轉錄病毒載體攜帶使用待轉移到靶細胞內的外源基因。此外，與啟動子和轉錄起始位點合作的另一種調節(jié)元件(例如增強子序列、終止序列或內含子序列)可以存在于載體中，以便完成外源基因的有效轉錄。待轉移到靶細胞內的外源基因可以是天然存在的基因或人工制備的基因。可替代地，外源基因可以是其中不同起源的DNA分子通過已知方法例如連接結合在一起的那種。希望轉移到細胞內的任何基因可以選擇為由逆轉錄病毒載體攜帶的外源基因。例如，編碼與待治療的疾病相關的酶或蛋白質的基因、細胞內抗體(參見例如WO 94本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：百百克行，齊藤尚紀，蝶野英人，峰野純一，
申請(專利權)人：寶生物工程株式會社，
類型：
國別省市：