本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與應(yīng)用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)所提供的植物WRKY6蛋白，來(lái)源于擬南芥、油菜等物種，但不局限于這些物種，包括與擬南芥中AtWRKY6（氨基酸序列如SEQIDNO:2所示）的同源性高于30%的類(lèi)似蛋白。擬南芥WRKY6蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一：（1）序列表中的SEQIDNO:1；（2）編碼序列表中SEQIDNO：2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)可為延緩葉片衰老、提高作物產(chǎn)量品質(zhì)及多重抗逆性方面提供了蛋白資源和方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于植物基因工程
，具體涉及一種調(diào)控葉片衰老和多重抗逆性的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
植物衰老是植物個(gè)體內(nèi)部一系列程序化的漸行性衰退，最終走向死亡的過(guò)程。葉片衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育的組成部分，構(gòu)成了植物葉片發(fā)育的最后一個(gè)階段，被認(rèn)為是程序 性細(xì)胞死亡(PCD)的一種，以依賴(lài)葉齡的方式進(jìn)行，并由諸多環(huán)境因素誘導(dǎo)，受生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期復(fù)雜的內(nèi)、外因素的相互作用影響。因此葉片衰老并不是被動(dòng)的過(guò)程，而是一個(gè)主動(dòng)調(diào)控的過(guò)程。葉片衰老過(guò)程中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理代謝、基因表達(dá)方面都經(jīng)歷一系列有序的變化。另外，由于葉片衰老過(guò)程中涉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用，對(duì)整個(gè)植株來(lái)說(shuō)，葉片衰老是植物健康生長(zhǎng)，繁育優(yōu)良后代的關(guān)鍵(Buchanan-Wollaston V等，Plant Biotechnol J,1(1):3-12,2003 ；Lim PO 和 Nam HG 等，Curr Top Dev Biol, 67:49-83，2005)。植物激素對(duì)植物發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境具有極其重要的作用。在眾多植物激素中，細(xì)胞分裂素(CK)對(duì)植物葉片衰老的延緩以及乙烯(ET)對(duì)葉片衰老的促進(jìn)作用是十分明確的，而且在不同物種中都得到了相對(duì)一致的結(jié)果。其它相關(guān)激素，如脫落酸(ABA)，赤霉素(GA)，茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)等都對(duì)葉片的衰老起到不同程度的促進(jìn)作用，但是對(duì)于它們的作用機(jī)理，特別是他們復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，仍知之甚少。茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)主要是參與植物防御反應(yīng)的激素，但是其在葉片衰老過(guò)程中也有一定的作用。對(duì)離體葉片外施JA可以加速其衰老進(jìn)程，但是在影響JA合成的突變體中并沒(méi)有觀察到葉片衰老延緩的現(xiàn)象，其中12%的葉片衰老相關(guān)基因并沒(méi)有發(fā)生變化(Xie DX 等，Science, 280:1091-1094,1998 ；Buchanan-ffolIaston V 等，PlantJournal, 42 :567_585，2005)。在葉片衰老過(guò)程中，植物體內(nèi)的SA含量急劇的上升，但在未衰老葉片中并不存在這樣的現(xiàn)象。此后，Morris等通過(guò)對(duì)'轉(zhuǎn)基因材料,及相關(guān)突變體pad4和的分析,發(fā)現(xiàn)這些突變體中衰老標(biāo)志基因SAGs表達(dá)有所改變(Morris K等，Plant Journal, 23 :677_685，2000)。SA對(duì)衰老的作用可能是影響了葉片衰老進(jìn)程中從衰老向細(xì)胞死亡變化的進(jìn)程。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因其N(xiāo)端含有由WRKYGQK組成的高度保守的氨基酸序列而得名。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了 74個(gè)WRKY成員，而水稻中則含有105個(gè)完整的WRKY成員。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY結(jié)構(gòu)域及其專(zhuān)一結(jié)合的(T) (T)TGAC (C/T)序列(又稱(chēng)W-box)更多地存在于與抗病、損傷、衰老相關(guān)基因和水楊酸誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)域。已有大量證據(jù)表明，WRKY與上述幾種生物和非生物逆境激發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切(Eulgem T等，EMBO J，18 =4689-4699,1999 ；Chen C等，Plant Physiol，129 :706_716，2002)。此外，在果實(shí)成熟、種子表皮毛發(fā)育、蔗糖信號(hào)傳導(dǎo)及赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了 WRKY基因的表達(dá)(Johnson CS等，PlantCell, 14 :1359-1375,2002 ；Sun C 等，Plant Cell，15 :2076_2092，2003)。Dong等研究了 72個(gè)擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病方面的作用，發(fā)現(xiàn)其中的49個(gè)受到病原菌syringae pv tomato (Α )和SA的誘導(dǎo)而產(chǎn)生表達(dá)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)參與擬南芥的抗病過(guò)程。作為調(diào)控系統(tǒng)獲得性抗性SAR的關(guān)鍵基因 (Cao WH 等，Plant Physiol，143 :707_719，2007)和/^7 等，其啟動(dòng)子中都含有W-box (Rushton PJ 等，Plant Mol Biol, 29:691-702,1995)。通常 NPRl 在植物中的表達(dá)水平很低，但用病原體感染或外施SA后，其表達(dá)量增加2-3倍(Cao WH等，Plant Physiol,143 :707-719,2007),同時(shí)抗多種病原體的能力顯著增加。DNA序列分析表明，似況7啟動(dòng)子中28個(gè)核苷酸的序列內(nèi)含有3個(gè)W-box。這些W-box是WRKY蛋白結(jié)合所必需的，如果其中的某個(gè)核苷酸被替換，WRKY蛋白就不再與之結(jié)合，其SA誘導(dǎo)的表達(dá)即完全消除，此時(shí)，植物對(duì)病原體的反應(yīng)變得非常敏感。另有研究發(fā)現(xiàn)，WRKY18、WRKY59、WRKY70等8個(gè)基因是NPRl的直接目標(biāo)，參與了植物的SAR過(guò)程，顯示了 WRKY參與SAR的機(jī)理的復(fù)雜性(Wang D等，Science，308 :1036-1040，2005 ；ffang D 等，Plos Pathogens,2 :1042_1050，2006)。PRl基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的^浴基因表達(dá)分析及Northern印跡分析都表明，其受到WRKY6的激活，且在防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)條件下這種激活更快、更強(qiáng)(Robatzek S等，Genes Dev, 16 :1139-1149, 2002)。WRKY在信號(hào)交叉和對(duì)話中也有重要作用。Li等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtWRKY70受SA的誘導(dǎo)，而JA和乙烯則沒(méi)有誘導(dǎo)作用；相反，用JA處理葉片后，AtffRKY70不表達(dá)而AtCORl則被大量誘導(dǎo)；同樣，在^轉(zhuǎn)基因植株中，SA的合成及其對(duì)WRKY的誘導(dǎo)作用消失；在過(guò)表達(dá)AtWRKY70的植株中，與SAR相關(guān)的基因和PR-5高水平表達(dá)，植株的抗病性提高，而JA誘導(dǎo)的AOMV基因則被抑制，但體內(nèi)SA、JA和乙烯的含量卻沒(méi)有明顯的變化(Li J等，Plant Cell,16 :319-331,2004 ; Abuqamar S 等，Plant Journal,48 :28-44,2006)。在擬南芥中，除AtWRKY70外，AtffRKY25和AtWRKY33可能也是平衡植物SA、JA防衛(wèi)信號(hào)途徑的一個(gè)重要決定因子(Li J 等，Plant Cell, 16 :319-331,2004 ；Zheng XL 等，Plant CellReports, 26 :1195-1203, 2007)。此外在葉片衰老方面，參與植物抗病的WRKY因子的部分成員也參與了這個(gè)生理過(guò)程，說(shuō)明WRKY家族的功能具有多元化的特征。Murray等(MurraySL等，MPMI，20 :1431-1438,2007)研究表明，AtWRKY53是一個(gè)抗病性相關(guān)的重要調(diào)控因子，其功能缺失突變體更易受到的感染，反而對(duì)青枯菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受力(Hu J等，PloS ONE, 3 :e2589，2008)，但是也有證據(jù)表明AtWRKY53是一個(gè)葉片衰老早期階段表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(Hinderhofer K 等，Planta，213 :469_473，2001 ；Miao Y 等，Plant Mol Biol, 55 853-867,2004)。目前對(duì)AtWRKY6的研究較少，主要停留在現(xiàn)象觀測(cè)階段；對(duì)于WRKY家族調(diào)控植物葉片衰老和多重抗逆性的研究也為數(shù)不多，特別是對(duì)其調(diào)控的遺傳和分子機(jī)制還幾乎一無(wú)所知。借助擬南芥模式體系，挖掘W本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種植物轉(zhuǎn)錄因子WRKY6蛋白，來(lái)源于擬南芥、油菜物種，包括與擬南芥中AtWRKY6的同源性高于30%的類(lèi)似蛋白；是SEQ？ID？NO:？2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ？ID？NO:？2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ？ID？NO:？2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蒯本科，高炯，朱政，梁寧菁，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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