一種利普司他汀生產(chǎn)工藝制造技術

本發(fā)明專利技術公開了一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，采用特定的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)毒三素鏈霉菌，經(jīng)發(fā)酵、純化、精制而獲得利普司他汀。本發(fā)明專利技術以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要氮源和碳源，并通過調(diào)控發(fā)酵工藝和純化工藝，獲得高純度利普司他汀，使利普司他汀的生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價提高，解決了現(xiàn)有技術中存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價低的缺點。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于藥物合成領域，更具體的，本專利技術涉及一種利普司他汀的新的生產(chǎn)工藝。
技術介紹
利普司他汀(英文名Lipstatin)，白色油狀物，是一種用于生產(chǎn)新型減肥藥奧利司他的醫(yī)藥中間體。奧利司他是由發(fā)酵物利普司他汀經(jīng)一步加氫還原制得。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長效和強效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。毒三素鏈霉菌(拉丁學名：Streptomycestoxytricini?)為鏈霉菌科、鏈霉菌屬，孢子絲長，頂端2-3圈緊密大螺旋形。孢子橢圓形至柱形，表面光滑。抑制金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母、顆粒青霉。現(xiàn)有技術中，發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的工藝存在生產(chǎn)成本高(約2500~3000元/千克)、發(fā)酵效價低(約7000mg/L)的缺點。
技術實現(xiàn)思路
基于此，本專利技術的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種生產(chǎn)成本低、發(fā)酵效價高的利普司他汀的新的生產(chǎn)工藝。為實現(xiàn)上述專利技術目的，本專利技術采用了以下技術方案。一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：(1)?按2%-10%的接種量，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，2r>6℃~30℃發(fā)酵140~198小時，控制發(fā)酵液pH值為6.8~7.8，攪拌速度為60-160rpm；所述菌液中菌種濃度為15%-25%；以質(zhì)量百分含量計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油2.5%-6.5%、黃豆粉3%-8.5%、卵磷脂0.5%-2%、葵花油3%-10%、硫酸鎂0.01%-0.15%、碳酸鈣0.05%-0.4%；(2)?發(fā)酵結束后，酸處理，使發(fā)酵液的pH值為2-7，噴霧干燥獲得干菌絲體；(3)?將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮中，浸泡8~24小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(4)?在濾液中加入純水，得到濃度為35%~55%的丙酮溶液；加入12-18倍體積的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；(5)?減壓濃縮至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入15-25倍體積的乙腈，冷卻后，分層除油，收集乙腈相；(6)?減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入8-12倍體積的己烷，上硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(7)?減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，即得。上述發(fā)酵培養(yǎng)基以黃豆粉、葵花油、甘油等作為主要氮源和碳源。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，是在首先了解單個因素對毒三素鏈霉菌生長及利普司他汀表達的影響后，再通過正交實驗綜合考慮各因素之間的交互作用，經(jīng)統(tǒng)計學分析后確定培養(yǎng)基配方的。同時進行發(fā)酵工藝檢驗和優(yōu)選，從而選定發(fā)酵工藝，通過一系列純化工藝檢驗與優(yōu)化，從而確定了最終的純化工藝。優(yōu)選地，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油4.5%、黃豆粉6.5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸鎂0.15%、碳酸鈣0.4%。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括適量微量元素。添加微量元素促進了菌種對數(shù)期前體物質(zhì)的轉化。優(yōu)選地，步驟(1)中發(fā)酵溫度為27±1℃，發(fā)酵時間為140-192小時。優(yōu)選地，步驟(2)中采用25%-45%的硫酸進行酸處理，使發(fā)酵液的pH為4。優(yōu)選地，步驟(3)中加入10-14倍體積的丙酮中，浸泡12-16小時。優(yōu)選地，步驟(4)中丙酮溶液的濃度為45-55%。優(yōu)選地，步驟(6)中所述硅膠柱中的硅膠為80-120目。選擇這樣的目數(shù)是為了分離利普司他汀，使其與其他雜質(zhì)分開。通過上述工藝提高了發(fā)酵水平，使發(fā)酵水平達到10000mg/L以上，增加了回收率，使回收率達到75%。本專利技術的利普司他汀生產(chǎn)工藝采用特定的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)毒三素鏈霉菌，并通過控制發(fā)酵工藝和純化工藝，經(jīng)發(fā)酵、純化、精制而獲得利普司他汀，生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價提高，具體地說，具有以下有益效果：1、發(fā)酵時間短，一般6天即可達到最大發(fā)酵產(chǎn)量的90%；2、菌體得率高，可達到250~350克（菌體濕重）/升（發(fā)酵液）；3、發(fā)酵成本低，比當前成本低15%；4、分離工藝精密，獲得產(chǎn)物純度高，獲得的利普司他汀含量可以達到98%；5、利普司他汀效價高（包括相對含量和絕對含量），其表達量可達到8000mg/L到14000mg/L。附圖說明圖1是本專利技術實施例1的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜；圖2是本專利技術實施例2的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜；圖3是本專利技術實施例3的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜。具體實施方式以下結合附圖和具體實施例對本專利技術做進一步的描述。以下實施例均以20L發(fā)酵罐進行說明，所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均為工業(yè)級，含量均大于95%。實施例1??一種利普司他汀生產(chǎn)工藝包括如下步驟：A、配制發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量計，20L發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：甘油2.5%、黃豆粉3%、卵磷脂1.5%、葵花油5%、硫酸鎂0.01%、碳酸鈣0.05%，微量元素適量(氯化錳：0.001%，氯化鋅0.0015%)，余量為去離子水。常規(guī)方法滅菌培養(yǎng)基。B、接種，發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，接種量為發(fā)酵液的5%(V/V)，菌液的菌種濃度為15%；27℃±1℃發(fā)酵8天；采用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在7.0；發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，在該實施例中，攪拌速度為90rpm；C、純化發(fā)酵產(chǎn)物(1)?發(fā)酵結束后，用25%-45%的硫酸酸處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值為4，采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；(2)?將干菌絲體加入8倍體積的丙酮溶液中，浸泡10小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(3)?在濾液中加入純水，得到濃度為35%的丙酮溶液；加入15倍體積正庚烷，進行萃取，收集正庚烷相；(4)?減壓濃縮正庚烷相至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入20倍體積乙腈，冷卻后，分層除油；(5)?收集乙腈相，減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入10倍體積己烷，上80-120目硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(6)?減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結晶，收集晶本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟：(1)？按2%？10%的接種量，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，26℃~30℃發(fā)酵140~198小時，控制發(fā)酵液pH值為6.8~7.8，攪拌速度為60？160rpm；所述菌液中菌種濃度為15%？25%；以質(zhì)量百分含量計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油2.5%？6.5%、黃豆粉3%？8.5%、卵磷脂0.5%？2%、葵花油3%？10%、硫酸鎂0.01%？0.15%、碳酸鈣0.05%？0.4%；(2)？發(fā)酵結束后，酸處理，使發(fā)酵液的pH值為2？7，噴霧干燥獲得干菌絲體；(3)？將干菌絲體加入1？14倍體積的丙酮中，浸泡8~24小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(4)？在濾液中加入純水，得到濃度為35%~55%的丙酮溶液；加入12？18倍體積的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；(5)？減壓濃縮至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入15？25倍體積的乙腈，冷卻后，分層除油，收集乙腈相；(6)？減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入8？12倍體積的己烷，上硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(7)？減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，即得。...

【技術特征摘要】
1.一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟：
(1)?按2%-10%的接種量，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，2
6℃~30℃發(fā)酵140~198小時，控制發(fā)酵液pH值為6.8~7.8，攪拌速度為
60-160rpm；所述菌液中菌種濃度為15%-25%；
以質(zhì)量百分含量計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油2.5%-6.5%、黃豆粉3
%-8.5%、卵磷脂0.5%-2%、葵花油3%-10%、硫酸鎂0.01%-0.15%、碳酸
鈣0.05%-0.4%；
(2)?發(fā)酵結束后，酸處理，使發(fā)酵液的pH值為2-7，噴霧干燥獲得干
菌絲體；
(3)?將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮中，浸泡8~24小時，板框過濾
除去菌絲，收集濾液；
(4)?在濾液中加入純水，得到濃度為35%~55%的丙酮溶液；加入12-1
8倍體積的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；
(5)?減壓濃縮至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入15-25倍體積
的乙腈，冷卻后，分層除油，收集乙腈相；
(6)?減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入8-12倍體積的己
烷，上硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：安鴻，尹海濱，
申請(專利權)人：廣州明新醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：