本發明專利技術提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。所述LAMP檢測引物如SEQ?ID?NO：1-6，利用所述的LAMP檢測引物，以BstDNA聚合酶大片段啟動環介導等溫擴增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結果。本發明專利技術提供的一種普遍適用于基層實驗室的快速、簡便、準確、特異檢測轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法，快速、高效、簡便，擴增特異性高，保證了結果的準確性。
【技術實現步驟摘要】
?本專利技術提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。
技術介紹
隨著全球轉基因產品的日益增多，以及越來越多的轉基因作物特異品系獲得商品化生產，檢測特異性品系已成為國際上轉基因成分檢測的發展趨勢。目前，檢測轉基因特異品系的方法主要有普通PCR方法和實時熒光PCR方法。普通PCR方法，具有耗時長，操作繁瑣，靈敏度不夠，容易產交叉污染，質控復雜，假陽性、假陰性比例偏高等缺點。實時熒光PCR方法則具有成本昂貴、技術要求高、需要大型的儀器設備等缺點，均已經不能滿足食品中轉基因成分的日常監管和食品生產行業內部質控的需求。因此，目前急需建立能夠普遍適用于檢驗檢疫一線的基層實驗室的快速、簡便、準確的轉基因品系檢測方法。環介導等溫擴增技術?(?loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)是2000?年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6?個區域設計4~6?條特異引物，利用一種鏈置換DNA?聚合酶在等溫條件(63?℃左右)?保溫30－60分鐘，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物（焦磷酸鎂），形成乳白色沉淀，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定結果。LAMP技術具有簡便、高效、特異、快速等優點，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，在靈敏度、特異性能媲美甚至優于普通PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。LAMP技術在食源性致病微生物的快速檢測中已得到廣泛應用，但在轉基因產品檢測上的應用研究很少。目前，國內采用LAMP技術對轉基因成分的研究尚處于起步階段，且主要應用于啟動子、外源基因的檢測，極少應用于轉基因特異品系的檢測。目前未見轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法的研究報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種普遍適用于基層實驗室的快速、簡便、準確、特異檢測轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法。本專利技術首先提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物，所述LAMP檢測引物如下：外引物F3：5'-GCT?GTA?GTT?GTT?GGC?TGT-3'外引物B3：5'-CCT?TTT?AAC?TGA?TGT?TTT?CAC?TT-3'?內引物FIP：5'-TGG?GGG?ATC?CAC?TAG?TTC?TAG?AGG?TGG?AAA?GTT?CCC?AGT?TGA-3'內引物BIP：5'-GCA?GGT?CGA?GGT?CAT?TCA?TAT?GGA?CCA?GGT?AAT?CTT?ACC?TTT?G-3'環引物LF：5'-CTG?CAC?TTC?CTC?TTT?AGC?ATC?C-3'環引物LB：5'-CTT?GAG?AAG?AGA?GTC?GGG?ATA?GTC-3'。本專利技術還提供了一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法，利用所述的LAMP檢測引物，以Bst?DNA聚合酶大片段啟動環介導等溫擴增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結果。環介導等溫擴增的反應條件為：63℃溫育1h，80℃保溫5min；反應體系為：10?×ThermoPol緩沖液2.5μL，10?μmol/L外引物F3?0.5μL，10?μmol/L外引物B3?0.5μL，40?μmol/L環引物LF?0.5μL，40?μmol/L環引物LB?0.5μL，40?μmol/L內引物FIP?1.0μL，40?μmol/L內引物BIP?1.0μL，10?mmol/L?dNTPs?3.5μL，5?mol/L甜菜堿?4.0μL，150?mmol/L硫酸鎂1.0μL，8?U/μL?Bst?DNA聚合酶大片段1.0μL，100?ng/μL?DNA模板2.0μL，ddH2O?7μL。本專利技術建立的LAMP檢測方法的優點：①快速、高效：擴增約1?h即可完成，且產率高；②簡便：在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，通過觀察濁度或加入顯色液觀察顏色變化就可判定檢測結果，不需要特殊的、昂貴的儀器設備，操作非常簡便；③高特異性：采用六個區段、四條或六條引物，擴增特異性高，保證了結果的準確性。????國內外還未見轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物及方法的報道，本專利技術首次設計、篩選到了轉基因GA21品系的LAMP檢測引物，并建立了LAMP檢測方法。附圖說明圖1為GA21品系外源基因的序列，加框部分是mepsps基因，陰影部分是linker基因，加下劃線部分是r-act基因。圖2為GA21品系在植物基因與外源基因組合連接處的序列。圖3為3套引物反應溫度的測試結果，A.set1引物；B.?set2引物；C.?set3引物；1~6.?反應溫度分別為：60.0℃、61.2℃、61.9℃、63.3℃、64.1℃、64.8℃。圖4為3套引物在反應溫度為63℃的特異性測定結果，A.?set1引物；B.?set2引物；C.?set3引物；1.?ddH2O；2.?非轉基因玉米；3.?非轉基因小麥；4.?非轉基因大豆；5.?5%?GA21標準品。圖5為LAMP方法的特異性試驗結果，A1~7分別為：ddH2O、非轉基因大米、非轉基因小麥、非轉基因玉米、非轉基因大豆、非轉基因番茄、非轉基因馬鈴薯；?B1~6分別為：轉基因玉米Mon89034品系、轉基因玉米Tc1507品系、轉基因玉米Mir604品系、轉基因玉米Mon810品系、轉基因玉米Bt11品系、5%GA21標準品。圖6為LAMP法靈敏度測定實時監控結果，1.?0.1%?GA21；2.?1%?GA21；3.?5%?GA21；4.?0.5%?GA21；5.?0.05%?GA21；6.?0.01%?GA21；7.?非轉基因玉米。圖7為LAMP法靈敏度測定結果，1.?非轉基因玉米；2.?0.01%?GA21；3.?0.05%?GA21；4.?0.1%?GA21；5.?0.5%?GA21；6.?1%?GA21；7.?5%?GA21。圖8為送檢樣品中GA21品系的LAMP檢測結果，A1~10分別為：ddH2O、非轉基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米（進口）、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆；B1~10分別為：香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白粿干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉；C1~10分別為：薯片、番茄醬、進口轉基因玉米酒糟粕、進口轉基因玉米1、進口轉基因玉米2、進口轉基因玉米3、進口轉基因玉米4、進口轉基因玉米5、0.1%?GA21、5%?GA21。具體實施方式1??試驗材料5%、1%、0.1%GA21標準品購自北京世紀奧科生物技術有限公司。非轉基因玉米、真空玉米棒、冷凍甜玉米、奶香味韓味玉米（進口）、辣味韓味玉米、玉米淀粉、黃大豆、油豆腐、脫脂大豆、香干、正康雞蛋豆奶、正本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物，其特征在于：所述LAMP檢測引物如下：外引物F3：5“？GCT？GTA？GTT？GTT？GGC？TGT？3“外引物B3：5“？CCT？TTT？AAC？TGA？TGT？TTT？CAC？TT？3“？內引物FIP：5“？TGG？GGG？ATC？CAC？TAG？TTC？TAG？AGG？TGG？AAA？GTT？CCC？AGT？TGA？3“內引物BIP：5“？GCA？GGT？CGA？GGT？CAT？TCA？TAT？GGA？CCA？GGT？AAT？CTT？ACC？TTT？G？3“環引物LF：5“？CTG？CAC？TTC？CTC？TTT？AGC？ATC？C？3“環引物LB：5“？CTT？GAG？AAG？AGA？GTC？GGG？ATA？GTC？3“。
【技術特征摘要】
1.一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測引物，其特征在于：所述LAMP檢測引物如下：
外引物F3：5'-GCT?GTA?GTT?GTT?GGC?TGT-3'
外引物B3：5'-CCT?TTT?AAC?TGA?TGT?TTT?CAC?TT-3'?
內引物FIP：5'-TGG?GGG?ATC?CAC?TAG?TTC?TAG?AGG?TGG?AAA?GTT?CCC?AGT?TGA-3'
內引物BIP：5'-GCA?GGT?CGA?GGT?CAT?TCA?TAT?GGA?CCA?GGT?AAT?CTT?ACC?TTT?G-3'
環引物LF：5'-CTG?CAC?TTC?CTC?TTT?AGC?ATC?C-3'
環引物LB：5'-CTT?GAG?AAG?AGA?GTC?GGG?ATA?GTC-3'。
2.一種轉基因玉米GA21品系的LAMP檢測方法，其特征在于：利用權利要求1所述的LAM...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邵碧英，陳文炳，曾瑩，繆婷玉，彭娟，
申請(專利權)人：福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：
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