本發明專利技術公開了一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養和保存植物寄生線蟲的方法。本發明專利技術通過以下步驟實現：新鮮甘薯經洗凈、表面消毒、削皮和切片放入培養皿后在培養箱中培養獲得甘薯愈傷組織；取經消毒處理的植物寄生線蟲接種到甘薯愈傷組織上；分別放在各自適宜溫度的培養箱中黑暗培養繁殖；培養一段時間后，將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4～20℃保存。本發明專利技術方法可實現即簡單、大量人工培養繁殖植物寄生線蟲，又能長期保存植物寄生線蟲資源的目的。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物寄生線蟲的繁殖培養和保存方法，具體涉及一種。
技術介紹
對于植物寄生線蟲，要研究其系統分類、分子生物學、功能基因組學以及蛋白質組學等基礎研究，或者在實驗室和田間進行生物學、病理學以及防治方法等基礎和應用研究，都需要大量、純化的線蟲。 然而，植物寄生線蟲大多都是專性寄生的，很難在純培養基上培養，只能在相應的寄生植物上繁殖。在實際中，人們往往利用植物組織培養技術在White(1963)、Krusberg (1961)和Gamborg’ s B5等植物組織培養基或I %水瓊脂培養基上，培養新鮮的植物愈傷組織、離體根或其他一些植物器官及整株植物幼苗，然后在這些植物材料上接種培養繁殖植物寄生線蟲；兼食真菌的植物線蟲，也可以用某些種類的真菌菌絲來培養(馮志新，2001)。不同類型線蟲的培養所采用的具體方法取決于其生物學特性。腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)和香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)都是遷移性內寄生線蟲，嚴重為害多種作物，均被我國列為檢疫性植物有害生物。對腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，目前可利用在培養基上培養的紫花苜蓿愈傷組織或真菌進行人工培養繁殖；對香蕉穿孔線蟲，則利用在培養基上培養的紫花苜蓿愈傷組織和胡蘿卜愈傷組織或利用無培養基的胡蘿卜片長出的愈傷組織，進行人工培養繁殖。但是利用培養基培養植物愈傷組織或真菌，再接種培養繁殖線蟲，操作復雜，同時易發生污染導致繁殖成功率和繁殖量低，直接用無培養基的胡蘿卜片長出的愈傷組織繁殖和培養保存香蕉穿孔線蟲的方法，也因胡蘿卜含水量大、易帶內生細菌發生腐爛，存在不能長期培養保存等缺陷。
技術實現思路
為克服現有技術的缺點與不足，本專利技術的目的在于提供一種。該方法可實現即簡單、大量人工培養繁殖線蟲，又長期保存線蟲資源的目的。本專利技術的目的通過以下技術方案實現一種，包含以下步驟(I)甘薯愈傷組織的制備將新鮮健康的甘薯洗凈晾干，用酒精浸泡后，灼燒，至表皮變暗，削去表皮，切成甘薯片，放入滅菌培養皿中，封口，于22 28°C暗培養至長出甘薯愈傷組織；(2)植物寄生線蟲的消毒和接種挑取或吸取植物寄生線蟲，消毒，然后離心，去除上清，將沉淀的線蟲用無菌水混勻繼續離心，去除上清，最后將沉淀的線蟲用無菌水稀釋分散滴在甘薯愈傷組織上，封口 ；(3)植物寄生線蟲的繁殖培養將步驟(2)中接種了植物寄生線蟲的甘薯愈傷組織進行暗培養繁殖，培養溫度為植物寄生線蟲繁殖的適宜溫度；(4)植物寄生線蟲的保存將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4 20°C保存；步驟(I)中所述的酒精選用工業酒精即可，其濃度優選為質量百分比70% ； 步驟(I)中所述的浸泡的時間優選為2min ；步驟(I)中所述的甘薯片的厚度根據培養皿的厚度，以距離皿蓋至少5mm為宜，優選厚度為4_，太厚靠近皿蓋，不易于接種，太薄容易缺失水份，薯塊易干，不易于長期培養、繁殖率低；步驟(I)中所述的培養皿可以是多種規格，優選直徑為6cm的培養皿；培養皿大太占用空間，太小則只放較小的薯塊，不利于提高線蟲的繁殖率，此外，6cm的培養皿便于保存；步驟(I)中所述的封口可用封口膜或者保鮮膜進行封口 ；步驟(I)中所述的暗培養的溫度更優選為25°C ；步驟(I)中所述的于22 28°C暗培養至長出甘薯愈傷組織的時間一般為10 15天;步驟(2)中所述的植物寄生線蟲優選為腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)或香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)；步驟(2)中所述的消毒優選為使用質量百分比O. 2%的硫酸鏈霉素溶液處理3 12h，可以達到消毒目的，不影響其正常的繁殖發育；步驟(2)中所述的離心的條件優選為4000rpm離心2min ；步驟(3)中所述的培養溫度要根據被培養繁殖的植物線蟲種類的生物學特性確定；因為植物寄生線蟲不同屬、種間的生物學特性存在差異，最合適的生長溫度有所不同；當所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲時，所述的培養溫度為20 25°C ；當所述的植物寄生線蟲為起絨草莖線蟲時，所述的培養溫度為17 20°C ；當所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的培養溫度為25 30°C ；步驟(4)中所述的植物寄生線蟲優選為在甘薯愈傷組織上培養50天的植物寄生線蟲；步驟(4)中所述的保存的溫度如下所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲時，所述的保存的溫度為4°C ;所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的保存的溫度為20°C ；上述，包括線蟲繼代培養的步驟，是在接種擴繁線蟲的甘薯愈傷組織培養皿中加入無菌水，然后挑出或吸取線蟲，重復步驟(2 )和(3 )即可達到繼代培養之目的。與現有技術相比，本專利技術具有以下優點和有益效果目前，利用甘薯愈傷組織繁殖和培養保存腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)或香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)這3種植物寄生線蟲的方法尚未有報道。本專利專利技術利用無培養基培養的甘薯愈傷組織繁殖培養和保存植物寄生線蟲的方法，操作簡單、成功率和繁殖率高，并且也可以實現對這3種線蟲的更長時間的保存。本專利技術的方法既可實現簡單、大量繁殖腐爛莖線蟲、起絨草莖線蟲和香蕉穿孔線蟲，又能長期培養保存這些線蟲，具體如下(I)使用甘薯愈傷組織培養腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，與真菌培養方法相比，操作方法更加簡便，培養材料更易獲得；培養一段時間的線蟲比較容易聚集在培養皿底部，容易收集干凈的線蟲；此外，腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲屬于植物寄生線蟲，長期在真菌上培養會導致其對植物寄生和致病力的退化，在甘薯愈傷組織長期培養則能避免此情況發生。(2)使用無需培養基培養的甘薯愈傷組織培養腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，與用培養基培養的苜蓿愈傷組織培養這兩種線蟲的方法相比，操作步驟簡單，對人員操作要求低，省時、省力，且成功率高。主要表現在1)本專利技術不需要配制培養基；2)甘薯愈傷組織一般在7天就可以長出，10 15天則可以在薯塊上長滿薯塊，但用培養基培養的苜蓿愈傷組織需要I個月；3)甘薯的切片規則，有一個愈傷組織平面，容易接種線蟲，而苜蓿愈傷組織不規則，不易接種線蟲；4)用培養基培養的苜蓿愈傷組織需要在非常嚴格的無菌條件下操作，很容易污染，而本專利技術操作簡單，較少發生污染；5)這兩種線蟲在無培養基培養的甘薯愈傷組織上繁殖率高。(3)使用甘薯愈傷組織培養香蕉穿孔線蟲，與胡蘿卜愈傷組織培養香蕉穿孔線蟲相比，甘薯相比胡蘿卜，含水量較少，較少滋生細菌，甘薯愈傷組織培養成功率高、不易腐爛、能長期培養保存。胡蘿卜含水量較高，內部易感染細菌，很容易在切片消毒后在未長出愈傷組織前出現壞死斑或腐爛，不能用以培養線蟲，浪費人力和物力；而培養出的愈傷組織接種香蕉穿孔線蟲后，也因含水量較高，而較快腐爛，因此不能在同一塊胡蘿卜愈傷組織上長期培養保存香蕉穿孔線蟲，需要較頻繁的將香蕉穿孔線蟲轉接到新的胡蘿卜愈傷組織上進行續培養保存，因此工作量大。附圖說明圖I是切好的薯片照片圖。圖2是2周后長出愈傷組織的甘薯薯片照片圖。圖3是使用甘薯愈傷組織培養腐爛莖線蟲(Ditylenchu本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）甘薯愈傷組織的制備：將新鮮健康的甘薯洗凈晾干，用酒精浸泡后，灼燒，至表皮變暗，削去表皮，切成甘薯片，放入滅菌培養皿中，封口，于22～28℃暗培養至長出甘薯愈傷組織；（2）植物寄生線蟲的消毒和接種：挑取或吸取植物寄生線蟲，消毒，然后離心，去除上清，將沉淀的線蟲用無菌水混勻繼續離心，去除上清，最后將沉淀的線蟲用無菌水稀釋分散滴在甘薯愈傷組織上，封口；（3）植物寄生線蟲的繁殖培養：將步驟（2）中接種了植物寄生線蟲的甘薯愈傷組織進行暗培養繁殖，培養溫度為植物寄生線蟲繁殖的適宜溫度；（4）植物寄生線蟲的保存：將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4～20℃保存。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：謝輝，徐春玲，李宇，丁莎，李克梅，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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