一種極暗黃鏈霉菌（Streptomyces?fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M2012519。本菌株對農作物病具有廣譜拮抗作用，對辣椒疫霉病菌、桃樹褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有較好的抑制作用，對水稻紋枯病菌的抑制效果尤為明顯。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種微生物
，具體指一種對農作物病具有廣譜拮抗作用，尤其對水稻紋枯病具有明顯抑制作用的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
技術介紹
水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的導致水稻減產的重要病害，可造成10%_30%的產量損失，發病嚴重時減產可達50%。近幾年，隨著高產雜交稻品種的推廣，施氮水平的提高，水稻復種指數的上升，水稻紋枯病的危害越來越嚴重。目前我國水稻紋枯病的防治主要以井R霉素與一些化學藥劑為主，長期單一使用井R霉素易導致立枯絲核菌產生抗藥性，近年井R霉素每季用藥次數已從20年前2次增加到現在的3-5次， 用藥量也從I. 5 kg/hm2上升到4. 5-6. Okg/hm，而化學藥劑存在毒性、殘留、環境污染等缺點，且由于立枯絲核菌腐生能力強和寄主范圍廣的特點，國內外至今尚未發現對該病的高抗品種。且，隨著化學殺菌劑對生態環境、有益生物及人體所引致負作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗藥性，利用一些生物防治菌作為生物殺菌劑來防治植物病害，以減輕化學農藥對環境污染的研究引起各界的密切關注。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種對農作物病具有廣譜拮抗作用的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40,尤其對水稻紋枯病菌具有良好的抑制效果。本專利技術所述的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40,已于2012年12 月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO :M2012519，保藏地址中國武漢武漢大學。本專利技術菌株CZB40具有以下性質形態特征使用插片法在高氏I號培養基上28°C培養7d后，分別用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察發現，本菌株具有典型的鏈霉菌屬特征，菌落緊密、表面皺折，皮殼狀，青褐色。氣生菌絲和基內菌絲均很豐富，在掃描電鏡下觀察發現，氣生菌絲體形成孢子鏈時，孢子絲呈螺旋狀，孢子呈短圓柱形，見圖I。生理生化特性本專利技術菌株CZB40在高氏一號固體培養基中生長產生暗黃色色素。本菌株能分解利用纖維素，使明膠液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能產生硫化氫。利用參照I. M. Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本專利技術菌株的基因組DNA，根據放線菌16SrDNA的結構特點及其保守區設計特異引物(引物由上海生工生物工程公司合成)正向引物16sF AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (見 SEQ ID NO. I)；反向引物16sR AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (見 SEQ ID NO. 2)。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增(50 μ L反應體系)94°C預變性5min， 94°C變性Imin，56°C復性Imin，72°C延伸2min，25個循環，72°C延伸8min。擴增產物經上海生工生物工程技術有限公司測序,序列經BLAST分析并構建系統發育樹(見圖2)表明，本專利技術菌株CZB40與極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)的相似性達99%。結合形態和生理生化特征分析，將其鑒定為極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)的一個新種， 命名為極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。培養及發酵條件培養基中的營養源并無特殊的規定，培養基中可含有常用于微生物培養的碳源、 氮源及其他營養源。其中，碳源可為葡萄糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可為NaN03、(MM)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他營養源可為含鎂、 鈉、鉀之類的金屬鹽等。對溫度、時間等培養條件并無嚴格的限制，以適于本專利技術菌株的生長為宜。將本專利技術菌株CZB40接種于發酵培養基中，可獲得發酵液，發酵培養基為玉米粉 10-30g、酵母粉 3-7g、MgSO4 O. 2_lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、1000ml 水，pH 5-9 ； 發酵條件為接種量1-10% (體積)、溫度26-30°C、搖瓶轉速150-250r/min、發酵培養時間為48-96h。通過單因素試驗和均勻設計法對本專利技術菌株CZB40的發酵培養基和發酵條件進行優化，得到最佳培養基(1000ml水)為25g玉米粉、5g酵母粉、O. 2g MgSO4、0. 8gNaCl、 O. 4gK2HP04 pH 6 ;最佳發酵條件為接種量5%、溫度29°C、轉速200r/min、發酵時間72h。本專利技術菌株對農作物病具有廣譜拮抗作用，對辣椒疫霉病菌、桃樹褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有較好的抑制作用，尤其對水稻紋枯病菌抑制效果明顯。附圖說明圖I是本專利技術菌株CZB40的孢子形態圖。圖2是本專利技術菌株的系統發育樹。具體實施方式下面以具體實施例對本專利技術作進一步說明，本文中提及的各病原菌均由湖南農業大學植物病理系提供。實施例I將從湖南省郴州市采集的土樣于室溫下風干，稱取土樣IOg放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩20min，用無菌移液管從中吸取Iml 土壤懸液注入盛有9ml 無菌水的試管中，混勻。從此試管中吸取Iml注入另一支盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制備10 -2、10 -3、10 —4、10 —5、10 —6的土壤稀釋液。用無菌移液管吸取10 -2、10 -4、10 -6 稀釋液O. ImL分別滴加到加有3%的抑菌劑(K2Cr2O7)的培養基平板上，用無菌涂布棒涂勻， 靜置30min后,將培養皿放在28°C溫箱中倒置培養。及時挑單菌落至高氏一號培養基上劃線純化，得到本專利技術菌株。其中，添加有3%的抑菌劑(K2Cr2O7)的培養基配方為可溶性淀粉20g、KNO3 lg、 K2HPO4 O. 5g、MgS04.7H20 0. 5g、NaCl 0. 5g、FeSO4. 7H20 0. Olg、瓊月旨 20g、水 lOOOmL、pH7. 2，加入的抑菌劑(K2Cr2O7) 3mL。實施例2將本專利技術菌株CZB40接種5% (體積)于發酵培養基(玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO4 0.2g、NaCl O. 8g, K2HP O4 O. 4g、1000ml 水；pH6)，28°C 下以 200r/min 轉速搖瓶發酵培養 72h，用細菌過濾器(直徑=0. 22 μ m)過濾，得發酵液。實施例3本專利技術菌株對水稻紋枯病菌的抑制作用于培養皿中加入3ml本專利技術菌株發酵液與12mlPDA，混勻制成平板(以3ml無菌水與12mlPDA混勻制成平板做對照)，將培養在PDA上的水稻紋枯病菌的小菌餅(直徑=5mm) 倒置放到平板中央，重復3次。靜置Ih后放入28°C溫箱倒置培養l-2d。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈透明程度和邊緣整齊程度，記錄結果并按下式計算抑制率菌落直徑=相垂直的兩直徑的平均值一菌餅直徑抑制率(％)=(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/(對照菌落直徑一菌餅直徑)X 100%。(這里提及的菌餅直徑皆是指水稻紋枯病菌的小菌餅(直徑=5mm))結果表明本專利技術本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種極暗黃鏈霉菌，其特征在于：該菌株為極暗黃鏈霉菌（Streptomyces?fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M2012519。
【技術特征摘要】
1.一種極暗黃鏈霉菌，其特征在于該菌株為極暗黃鏈霉菌(Streptomycesfulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCCNO M2012519o2.一種發酵法制備極暗黃鏈霉菌發酵液的方法，其特征在于發酵所用菌株為權利要求I所述的極暗黃鏈霉菌CZB40，發酵培養基為玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4O.2-lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、水 1000ml，pH 5-9 ;發酵條件為接種量 1_10%、溫度26-30°C、搖瓶轉速150-250r/min、發酵培...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱宏建，劉雙清，周清明，何龍，
申請(專利權)人：湖南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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