本發明專利技術提供一種重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。用目的基因來源于銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC?No.M?2012425作為發酵菌株進行液體發酵來制備溶血性磷脂酶C，其制備方法包括種子培養、液體發酵培養以及粗酶液的提取。利用本發明專利技術菌株通過液體發酵來生產溶血性磷脂酶C，產酶量和酶活性高，安全性好，制酶工藝簡單，成本低，易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性、醫療等領域具有一定的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程和微生物發酵
，具體涉及一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。
技術介紹
磷脂酶C (PLC)，又可稱為可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸單酯，細菌來源的磷脂酶C根據底物特異性的不同主要分為磷脂酰特異性磷脂酶C (PC-PLC)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C (PI-PLC)0 PLC水解產物甘油二酯是一種生理活性物質，在細胞信號傳導途徑上起著第二信使的作用，能激活蛋白激酶C (PKC)而引起細胞增殖、分化、收縮、分泌和代謝等功能變化，此外還具有明顯的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被稱作溶血性磷脂 酶C。溶血性PLC對新型抗血小板藥物、心腦血管疾病類藥物的開發具有一定的潛在價值，對抗靜脈血栓及高血壓醫療方面的研究意義重大。隨著對PLC研究的不斷深入及工業發展的需求，PLC的應用價值已經逐漸從藥品生產擴展至油脂精煉、磷脂改性、食品加工等領域。例如在油脂精煉中，利用PLA和PLC混合物進行酶法脫膠，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性堿脫膠具有更高的油產率；食品工業中PLC可用來改善在面包在烤制時其表面產生的老化現象，緩和梨皮狀表皮。近年來，隨著PLC在食品、醫藥、飼料等領域的廣泛應用，國內外學者對其進行了大量的研究。國外對PLC的研究一直處于領先水平，例如1982年Vasil等人構建了一株 P. aeruginosaPA02003 (pVB81) -CT，其所產溶血性 PLC 的酶活達到了 442. 8U/ml(Vasil ML, Berka MR, Gray GL, Nakai H. Cloning of aphosphate-regulated hemolysingene (phospholipase C)from Pseudomonasaeruginosa. Journal of Bacteriology,1982,152 :431-440. ) ；1990年Ostroff等人將構建的重組質粒pGEM2/PLC_H導入到E. coliBL21 (DE3)中，成功得到了一株產溶血性PLC的菌株，該菌株的PLC活性可達到166. 7U/ml (Ostroff RM, VasilAI, Vasil ML. Molecular comparison of a nonhemolytic and ahemolyticphospholipase C from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology,1990,172(10) :5915-5923.) ; 1997 年 Cota-Gomez 等人成功構建了 E. coli BL21 (DE3)pGEM-plcHR，該菌株可產溶血性PLC，其酶活達到24. IU/毫克(Cota-Gomez A, Vasil Al,Kadurugamuwa J,Beveridge TJ,Schweizer HP, Vasil ML. PlcRl and PlcR2are putativecalcium-binding proteins required for secretion of the hemolyticphospholipaseC of Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 1997,65 :2904-2913. X 國內對磷脂酶C的研究雖起步較晚，但也取得了一定成果，例如2005年陳濤等人對篩選到的產PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754_l進行三次紫外線和兩次Co60_ Y射線誘變處理，篩選出三株高PLC活性的誘變株，酶活分別達到14. 878、16. 450、16. 400U/ml (陳濤，王常高，劉曉輝，何東平.高產磷脂酶C菌株的誘變選育.天然產物研究與開發，2005，17 (6)712-716. ) ;2007年高林對Bacillus cereus Shenzhen 754-1進行培養條件的優化，將酶活提高至26U/mL (高林.磷脂酶C高產菌株的篩選、鑒定和培養條件的優化研究.安徽農業大學的碩士學位論文，2007. );2010年詹逸舒篩選到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黃瓊脂杯碟法測定該菌株所產生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直徑可達30_，酶活達到23.31U/ml (詹逸舒.產磷脂酶C菌株的篩選及其酶學性質的研究.湖南農業大學的碩士學位論文，2010.)。與動植物來源的PLC相比，上述微生物來源的PLC具有更短的生產周期，但仍存在如下弊端如野生菌株分離純化耗資大，大多數具有潛在病原性，在食品安全性方面存在一定隱患；基因工程菌株其構建和產酶工藝較為復雜，產酶量還有待提高。因此，目前高純度的PLC商業化生產尚未實現。
技術實現思路
針對現有技術存在的上述問題，本專利技術的目的在于提供一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。利用該菌株通過液體發酵來生產溶血性磷脂酶C，產酶量和酶活性高，安全性好，制酶工藝簡單，成本低。 本專利技術的技術方案如下一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET_plcH，保藏編號為 CCTCCNo. M 2012425。所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-p IcH, CCTCC No. M 2012425由下述方法制得(I)以保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的基因組為模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示；(2)將步驟(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a ( + )上，得到重組載體；(3)將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。本專利技術還提供了一種用上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH, CCTCCNo. M2012425制備溶血性磷脂酶C的方法，是以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備溶血性磷脂酶C。其具體步驟如下(I)種子培養將所述重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M2012425接種于種子培養基中，于30 37°C振蕩培養8 12h，搖床轉速150 200r/min ；(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比3 10%的接種量接種至發酵培養基，于30 37°C振蕩培養4 6h小時，搖床轉速150 200r/min ；再添加乳糖，于20 30°C振蕩誘導培養14 22h，搖床轉速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續振蕩誘導培養18 36h，發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取將步驟(2)所得發酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液。其進一步的技術方案為步驟(I)所述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g,NaCl9 llg，其余成分為水。步驟(2)所述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9 llg，酵母粉5 24g，甘油 0 5g，其余成分為 0. 25本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株重組大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）/pET?plcH，保藏編號為CCTCC?No.M?2012425。
【技術特征摘要】
1.一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-plcH，保藏編號為 CCTCCNo. M 2012425。2.根據權利要求I所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pIcH, CCTCC No. M2012425，其特征在于由下述方法制得 (1)以保藏編號為CGMCCNo. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的基因組為模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ ID NO :I所示； (2)將步驟(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a( + )上，得到重組載體； (3)將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。3.用權利要求I 2任一項所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M2012425制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備溶血性磷脂酶C。4.根據權利要求3所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具體步驟如下 (1)種子培養將所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No. M2012425接種于種子培養基中，于30 37°C振蕩培養8 12h，搖床轉速150 200r/min...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張梁，石貴陽，趙金星，丁重陽，顧正華，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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