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    一種提取水稻DNA的方法技術(shù)

    技術(shù)編號:8449199 閱讀:468 留言:0更新日期:2013-03-21 03:11
    本發(fā)明專利技術(shù)利用96深孔板以及混合研磨儀進行快速高效的水稻葉片或種子DNA的提取方法,涉及生物學(xué)領(lǐng)域,是一種快速有效的植物DNA的提取方法,提取全程無需單槍操作,全為排槍作業(yè),且不需寫編號,實現(xiàn)快速高通量的提取方法。可用于水稻分子育種、純度鑒定、種子真實性檢測、基因克隆等。

    【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

    本專利技術(shù)涉及到DNA的一種提取方法,尤其涉及到一種水稻葉片和谷粒等植物品種的DNA提取的方法。
    技術(shù)介紹
    SSR標記具有快速、準確,信息含量高、呈共顯性遺傳、易于分析和重復(fù)可靠等特點。因此,自1989年該技術(shù)產(chǎn)生以來,己被廣泛應(yīng)用于水稻基因定位和QTL分析,水稻品種 DNA指紋圖譜構(gòu)建、群體遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種、雜交組合真實性和純度鑒定、 轉(zhuǎn)基因品種檢測等方面。DNA提取是PCR分析的前提。目前以水稻葉片或種子為研究材料進行DNA提取的過程主要是采用2ml離心管,在每個單管中進行研磨、離心、轉(zhuǎn)管、單槍加樣等。提取步驟多,時間長,且每次轉(zhuǎn)管都需要寫編號,不適合DNA樣品的大量快速制備。
    技術(shù)實現(xiàn)思路
    為了解決現(xiàn)有技術(shù)不適合DNA樣品的大量快速制備的缺陷,本專利技術(shù)提供一種快速、簡便高通量提取水稻D NA的方法。為了實現(xiàn)上述的技術(shù)目的,本專利技術(shù)的技術(shù)方案是提出一種提取水稻DNA的方法。在本專利技術(shù)中,涉及到的植物材料優(yōu)選為水稻的幼苗或種子或成株的葉片。本專利技術(shù)采用的步驟包括a)、采用96孔深孔板對植物材料進行取樣;b)、在深孔板的每個孔中加入I粒小鋼珠,放入液氮中凍2-3分鐘;C)、安裝96深孔板適配器;d)、采用混合研磨儀對在96深孔板內(nèi)的植物材料進行研磨、粉碎;e)、利用8槍頭的排槍對深孔板內(nèi)的植物材料進行萃取;f)、萃取后的DNA進行室溫干燥;g)、干燥后的DNA加入滅菌雙蒸水溶解;h)、利用RM520進行PCR,并在瓊脂糖電泳上進行檢測。本專利技術(shù)的一種優(yōu)選方案是,所述萃取使用的萃取液的順序依次為I單位的I.5XCTAB (十六烷基三甲基溴化銨),I單位的氯仿/異戊醇(24:1)混合溶液,2/3單位異丙醇,并通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試驗。本專利技術(shù)的優(yōu)選實施方案是,植物材料為種植成8株X 12行的水稻幼苗或水稻的種子或水稻成株的葉片。本專利技術(shù)的一種優(yōu)選方案是,所述的研磨、粉碎的振蕩頻率為25-30HZ/S,所預(yù)計的時間為I. 5min。在本專利技術(shù)提到的96孔深孔板不僅限于96孔深孔板,也可以為48孔深孔板,24 孔深孔板,192孔深孔板,具體根據(jù)實際的需要選取。本專利技術(shù)提到的利用8槍頭的排槍不僅限于8槍頭的排槍,也可以為16槍頭的排槍,或4槍頭的排槍,可根據(jù)實驗人員的實際需要選取。本專利技術(shù)的技術(shù)效果是與一般植物DNA提取技術(shù)相比,有以下幾個優(yōu)點1)無需寫每份材料的編號;2)無需使用單槍,提取DNA過程全程使用排槍;3)可通量提取,一次操作即為96份樣;4)簡化了提取步驟,省時高效。附圖說明圖I為96孔板批量提取和一般單管提取的DNA電泳效果對比圖具體實施例方式SSR(Si mple Sequence Repeats)標記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù),也稱為微衛(wèi)星DNA(Micr0SatelliteDNA),是一類由幾個核苷酸(一般為I飛個)為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列.由于每個SSR兩 側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列。 用分子標記RM520對旱恢3號與B5材料的后代群體進行檢測,用96孔深孔板進行取樣(田間材料選擇種植成8株X 12行),在深孔板將材料取樣方向以及田間編號備注好。取約5cm左右的葉片卷著放入I. Iml深孔板中的離心管中,深孔板株行編號與田間編號對應(yīng);將樣帶回實驗室進行研磨,即在深孔板每個帶葉片孔中加入I粒小鋼珠,放入液氮中凍2-3分鐘,安裝96深孔板適配器對稱裝于混合研磨儀(Mixer Mill Type, Model:MM301),然后進行粉碎,以每秒25-30的頻率振蕩I. 5min,磨成粉樣;用排槍在96深孔板每個樣管中加入I. 5 X CTABC I. 5 X CTAB要56°C預(yù)熱)DNA提取緩沖液300 ul,56°C水浴30min,中間搖勻3-4次讓DNA充分裂解;用排槍加入等量氯仿/異戊醇(24:1) (300ul),室溫下振蕩20分鐘,3500rpm離心lOmin,將上清液(吸取IOOul)轉(zhuǎn)入PCR板中;加入2/3體積(67ul)的異丙醇(_20°C預(yù)冷),排槍上下吸混幾次,蓋好PCR板蓋,輕緩顛倒混勻后_20°C放置Ih以上或過夜,進行DNA沉淀,在將平板放于離心機上3500rpm離心lOmin,排槍洗掉上清液,沉淀的DNA室溫干燥,加入200ul滅菌雙蒸水溶解DNA,每次取2ul直接進行PCR。利用RM520進行PCR,并在瓊脂糖電泳上進行檢測。發(fā)現(xiàn)用96深孔板板提取DNA方法與2ml單離心管的提取方法的DNA檢測效果一致。本文檔來自技高網(wǎng)...

    【技術(shù)保護點】
    一種提取水稻DNA的方法,其步驟包括:a)、采用96孔深孔板對植物材料進行取樣;b)、在深孔板的每個孔中加入1粒小鋼珠,放入液氮中凍2?3分鐘;c)、安裝96深孔板適配器;d)、采用混合研磨儀對在96深孔板內(nèi)的植物材料進行研磨、粉碎;e)、利用8槍頭的排槍對深孔板內(nèi)的植物材料進行萃取;f)、萃取后的DNA進行室溫干燥;g)、干燥后的DNA加入滅菌雙蒸水溶解;h)、利用RM520進行PCR,并在瓊脂糖電泳上進行檢測。

    【技術(shù)特征摘要】
    1.一種提取水稻DNA的方法,其步驟包括 a)、采用96孔深孔板對植物材料進行取樣; b)、在深孔板的每個孔中加入I粒小鋼珠,放入液氮中凍2-3分鐘; C)、安裝96深孔板適配器; d)、采用混合研磨儀對在96深孔板內(nèi)的植物材料進行研磨、粉碎; e)、利用8槍頭的排槍對深孔板內(nèi)的植物材料進行萃取; f)、萃取后的DNA進行室溫干燥; g)、干燥后的DNA加入滅菌雙蒸水溶解; h)、利用RM520進行PCR,并在瓊脂糖電泳上進行檢測。...

    【專利技術(shù)屬性】
    技術(shù)研發(fā)人員:劉國蘭劉毅王飛名王加紅張安寧余新橋羅利軍
    申請(專利權(quán))人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心
    類型:發(fā)明
    國別省市:

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