本發明專利技術涉及與玉米油份含量相關的衣被蛋白復合體(COPII)基因位點及應用，屬于分子育種領域。本發明專利技術的玉米油份相關的位點為玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr8.S_38521846的SNP位點，該位點突變為G/T；以及位于玉米衣被蛋白復合體COPII基因(GRMZM2G003022)5’UTR區域InDel_20位點。可將分子標記用于玉米品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系油份含量的大小。本發明專利技術采用分子標記輔助選擇不僅準確性高，加快選擇進度，提高了育種效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及玉米油份含量相關的衣被蛋白復合體(COPII)基因位點及應用，屬于玉米育種和分子生物學領域。
技術介紹
高油玉米的籽粒油份含量超過6%，高油玉米不僅是人類健康食品與優質動物飼料，而且還是重要的工業原料。玉米油富含較多的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，對人體健康具有重要作用，因此又稱為健康油。同時利用高油玉米籽粒作為飼料可以顯著提高牲畜的產肉率。而且高油玉米秸桿富含粗蛋白和其他營養成分，也是食草動物良好的青貯飼料。玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。 其基本過程乙酰輔酶A經乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰單酰輔酶A.這是脂肪酸合成的第一關鍵步驟，也是調控整個脂肪酸合成的限速步驟。然后脂肪酸合成酶(FAS) 以丙二酰單酰輔酶A為底物進行連續的聚合反應，以每次循環增加2個碳鏈的頻率合成酰基碳鏈。而不斷增加的酰基碳鏈又與酰基載體蛋白(ACP)結合，ACP負責轉運脂肪酸合成途徑中的中間產物。經過數次聚合反應后，脂肪酸的合成在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉移酶的作用下終止。終止聚合反應后，不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基輔酶A合成酶的作用下生成酰基輔酶A，并從質體轉運到內質網或胞質中。最后利用儲存在胞質中的酰基輔酶A， 在內質網中通過3種不同的酰基轉移酶(甘油-3-磷酸酰基轉移酶GPAT、溶磷脂酸酰基轉移酶LPAAT、二酰甘油酰基轉移酶DGAT)。在甘油上附連脂肪酸以合成三酰甘油，并儲存在不連續分布的亞細胞器油體中。另外，脂肪酸合成后經過不同的修飾方式合成長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸。近年來，隨著大量植物全基因組測序的完成，植物基因組學的研究已經呈現出由簡單質量性狀向復雜的數量性狀轉移的趨勢，特別是大量SNP標記的開發以及生物信息學的迅猛發展，應用關聯分析方法發掘植物數量性狀基因已成為目前國際植物基因組學研究的熱點之一。關聯分析(Association Analysis),又稱連鎖不平衡作圖(LD Mapping)或關聯作圖(Association Mapping),是一種以連鎖不平衡為基礎鑒定某一群體內目標性狀與遺傳標記或候選基因關系的分析方法(Flint-Garcia et al，2003)。跟連鎖分析相比， 關聯分析具有以下優點(I)連鎖分析需要構建基于兩親本雜交的Fl衍生群體(F2、BC、 RIL等)，關聯分析可用現有的群體，大大縮短研究年限；(2)連鎖分析每次只能分析同一位點的2個等位基因，關聯分析可以同時分析同一位點的多個等位基因；(3)連鎖分析所用的群體小，加上群體來自兩親本，在群體內發生的重組次數少，這樣往往導致連鎖作圖的精度低，例如玉米的作圖精度一般為10 30cM(Salvi，2005 ;Flint_Garcia，2005，而關聯分析的精度可大大提高，例如玉米自交系的精度為1500bp，達到單基因水平(Remington， 2001)。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是通過以下技術方案來實現的AM508群體由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成(所述的群體材料，均為常見的玉米市售材料，可通過常規商業渠道購買得到)。候選基因重測序材料: 155份我國骨干自交系材料。從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系， 構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序。每個個體的reads數為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始數據。全基因關聯分析以AM508群體為材料,利用Illumina MaizeSNP50BeadChip對 56，110個位點進行了基因型檢測。從授粉15天后的508份材料中隨機選擇的368份材料則構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序，每個個體的reads數為73. 8±0. 7百萬堿基，共產生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高質量的SNP，分別對這兩個群體采用線性混合模型校正群體層化效應和親緣關系后與油脂相關性狀進行了高密度標記的全基因組關聯分析。為了綜合這兩個群體的結果，本研究研究使用了統一的閾值篩選顯著性的位點(建議水平顯著性閾值為1/N =1.78X IO-6以及5%基因組顯著性閾值為0. 05/N = 8. 94X10^)。為了在較多的顯著關聯信號中鑒定到唯一可能的因果突變基因，計算同一染色體上的顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡，過濾掉r2小于O. 02的標記。在定位到的單一的顯著性信號中。衣被蛋白復合體基因(COPII)位于玉米第8條染色體(GRMZM2G003022)。利用368 份材料關聯分析結果發現，位于玉米參考基因組上chr8. S_38521846的SNP位點，突變為G/ T，其中G為主要等位基因，T為最小等位基因，最小等位基因的頻率為O. 06，該SNP位點與玉米油份顯著相關，該SNP位點與玉米衣被蛋白復合體基因(COPII)基因(GRMZM2G003022) 緊密連鎖。玉米基因序列通過比對B73參考序列獲得,利用Primer Premier 5和Primer 3 設計引物擴增全長，利用MUSCLE軟件和BioEdit軟件進行多序列處理和比對，利用TASSEL2.O. I軟件提取SNP和InDel，同時通過1000次排列檢驗計算多態性間的r2值，采用F測驗計算兩個顯著性信號位點間兩兩的連鎖不平衡。根據COPII基因的InDel_20功能位點開發的標記序列如下PCR分子標記序列5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3,測序引物序列ZmCOPII Rl5' -AAATACCTAACCGCGACGAC-3'5' -GCCATCATCAATCCAGGG-3'ZmCOPII R25' -CACAGTGCCATTTCGATCA-3'5' -TAATACCAAGGGCAACCTCTAC-3'ZmCOPII R35' -TGGAAACAAGTCGCCTACC-3'5' -AGTGTAGGCCATGTCTGGTG-3'ZmCOPII R45' -TGTGGCACGGGAGTTTTC-3'5' -GGCTTTACCCTCAATATCGTCT-3'附圖說明下面結合附圖對本專利技術的具體實施例作進一步詳細的說明。圖Ia展示的是ZmCOPII基因內多態性位點與不同地區的油脂表型的關聯分析的結果。X軸為該基因的長度(bp)，其起始密碼子定義為lbp。Y軸為對線性混合模型計算得到的顯著性P值取負的以10為底的對數值。圖Ib ZmCOPII基因的結構及其功能結構域圖示。填充的黑色方塊表示外顯子，無色的方塊表示UTR區域，黑色虛線展示本研究中已測序的區域。黃色的橢圓形顯示的是該基因的功能域。InDel_20表示O或20bp的插入。R1、R2、以及R3、R4為用以測序的擴增序列片段。圖Ic為顯著關聯區域內的標記間兩兩配對的連鎖不平衡展示圖。每一個方塊內的顏色對應于腳注中不同顏色所代表的r2值。紫色星形指示了最顯著相關位點的位置。圖Id授粉15天后ZmCOPII基因表達水平與油脂含量的相關性分析圖。X軸為標準化后的ZmCOPII基因的表達水本文檔來自技高網...
【技術保護點】
玉米油份含量相關的衣被蛋白復合體(COPII)基因位點分子標記，其特征在于，所述的相關分子標記具體位點位于玉米參考基因組(www.maizesequence.org，5a.60版)chr8.S_38521846的SNP，該位點突變為G/T，以及位于玉米COPII基因(GRMZM2G003022)5’UTR區域InDel_20位點，上述位點與玉米油分含量顯著相關。
【技術特征摘要】
1.玉米油份含量相關的衣被蛋白復合體(COPII)基因位點分子標記，其特征在于，所述的相關分子標記具體位點位于玉米參考基因組(WWW. maizesequence. org,5a. 60版)chr8. S_38521846的SNP，該位點突變為G/T，以及位于玉米COPII基因(GRMZM2G003022)5> UTR區域InDel_20位點，上述位點與玉米油分含量顯著相關。2.如權利要求I所述的分子標記的應用，其特征在于，該應用包括以下步驟 a)由473個普通玉米自交系和35個高油玉米自交系組成AM508群體； b)從授粉15天后的AM508份自交系中隨機選擇368份自交系,構建200bp大小插入片段文庫，采用90bp末端配對的RNA測序技術進行轉錄組測序。3.如權利要求I所述的玉米衣被蛋白復合體(COPII)基因分子標記的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴建兵，楊小紅，李建生，李慧，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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