本發明專利技術公開了了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達方法，其步驟為中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達載體的構建和中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達；本發明專利技術成功表達了MIH蛋白，為進一步了解早熟蟹性腺提早發育的內在機理，了解蟹類蛻皮腺的功能機制并為進一步制定控制河蟹性早熟的技術措施提供理論基礎，獲得實現生長發育和繁殖的人工調控的基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因的表達方法，特別涉及到中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法。
技術介紹
脫皮是甲殼動物生長和發育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發育的始終，它受神經系統和內分泌系統共同調節。這個調節過程表現為兩種互為拮抗的激素作用。蛻皮激素的刺激作用和M IH的抑制作用。蟹類眼柄中所產生的MIH含量極微，并且家族其它神經肽在大小以及一級結構上的相似性限制了直接從動物體內分離并純化MIH蛋白。因此，常常用原核及真核蛋白表達系統來生產較大量的重組MIH(Yodmuang et al. , 2004 ；Lee and Watson, 2002 ；0hira et al.，1999 ;Sun，1997)。宋霞等(2003,2004)先后報道了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素基因Ers-MHII的部分cDNA序列及基因組DNA全序列(GeBnank檢索號 AY310313)。Ers-MIHI成熟肽包括75個氨基酸，相對分子質量(M) r約為7. 8kD，屬于小分子多肽。本實驗室的郭豫杰和姚燕曾將Ers-MIHI基因成熟肽的cDNA片段連接到原核表達載體PGEX-4T-1載體和pET-28a(+)載體上，在大腸桿菌中進行了融合表達(郭豫杰等，2004 ； 姚燕等，2006)，成功獲得融合蛋白。但以pGEX-4T-l為載體獲得的融合蛋白N端帶有26kD 的GST，龐大的標簽蛋白可能導致目的蛋白的空間構象不正確，因此需要在純化后用酶切去除標簽蛋白部分。但經凝血酶切除GST后獲得的目的蛋白一般N端殘留兩個氨基酸，而且切割后目的蛋白損失量較大，切割效率不高，從而導致融合蛋白往往檢測不出活性，影響了目的蛋白活性及功能的研究。而以pET-28a(+)為載體的融合蛋白沒有龐大的標簽蛋白，以 6His-tag為標簽，不僅便于純化而且分子量小，無免疫原性，不會影響被修飾蛋白質的生理 PH值，對目的蛋白的分泌、構象或胞內折疊及純化后的功能活性幾乎無影響，不用設法切除 (王華等，2002)。但由于目的蛋白在原核細胞內表達不穩定，易被細菌蛋白酶降解。基因工程的發展使許多微量蛋白大量表達，也使許多以前難以制備的蛋白得到表達成為可能。大腸桿菌E. coli表達系統是目前為止最為有效的和方便的表達系統，可以進行許多異源蛋白的高效表達。但在進行一些蛋白的表達時，會產生許多困難。外源蛋白在 E. coli中的大量表達是以不溶性的包涵體的形式存在于細胞內，而包涵體的分離破碎通常會造成目的蛋白的失活；真核蛋白在E. coli的表達會有更多的問題由于真核基因通常含有內含子，在E. coli中不能進行正確的剪切和拼接，因此必須表達它的cDNA序列。另外， 真核生物的許多蛋白都是糖蛋白，用E. coli作為表達宿主，不能對真核蛋白進行正確的糖基化等翻譯后加工，很難得到有活性的真核表達系統。
技術實現思路
I、專利技術要解決的技術問題針對現有對中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達上的缺陷和不足，特別畢赤酵母表達系統對許多蛋白表達不理想，甚至不表達，要實現中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核在畢赤酵母中的成功表達并兼顧其實用性和安全性。必須充分考慮影響表達和應用的以下因素(I)目的基因特性的改造；(2)啟動子的選擇；(3)糖基化的消除；(4)提高產物的穩定性，本專利技術提供了中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I(Ers-MIHl)基因的真核表達方法，獲得實現生長發育和繁殖的人工調控奠定重要的基礎。2、
技術實現思路
(I)專利技術原理巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是目前應用最為廣泛的酵母表達系統。由于該系統比原核生物及其它真核生物表達系統具有以下優點，已被廣泛地用于外源蛋白的表達。①具有強有力的乙醇氧化酶(Alochol 0xidaSe，A0Xl)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；②作為真核表達系統,可對表達的蛋白進行翻譯后的加工與修飾,從而使表達出的蛋白具有生物活性；③營養要求低，生長快，培養基廉價，便于工業化生產；④具有強烈的好氧生長偏愛性，使得它既能高密度發酵生長，亦有利于工業放大生產，可進行細胞高密度培養，此外，Pichia pastoris能夠忍耐較寬的pH范圍(3. 0-7. O)， 利于在發酵過程中通過調節PH來抑制蛋白水解酶的活性，防止表達的外源蛋白的降解；⑤在P. Pastori中表達的蛋白既可存在于細胞內，又可分泌到胞外；⑥糖基化程度低，其糖基化位點與哺乳類細胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，而且表達產物不含有毒物質和致熱原；⑦胞內表達的分選和區域化。.畢赤酵母的表達載體為整合型質粒，質粒載體與酵母染色體具有同源序列，線性化的質粒通過同源序列而整合到酵母染色體上。質粒PPIC9上帶有編碼組氨酸脫氫酶的基因HIS4，而宿主菌GSl 15為HIS4缺陷型，因此只有質粒轉化菌才能在缺少組氨酸的MD平板上生長。畢赤酵母一般先在含有甘油的培養基中生長，培養至高密度后，再以甲醇為唯一碳源，誘導表達外源蛋白，這樣可以提高表達產量(Cregg et al, 1993 ；Romanos et al, 1992)。上述特點使得巴斯德畢赤酵母表達系統為中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIH) I 基因的表達提供了一個良好條件，利用酵母表達載體合成重組多肽的方法獲得具有生物活性的多肽，對于研究甲殼類眼柄神經激素的結構、功能和作用方式起到重大的作用。為進一步認識中華絨螯蟹生長蛻皮調控機制，最終實現生長發育和繁殖的人工調控奠定重要的基礎。(2)技術方案中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIHl)基因的真核表達方法，其步驟包括為步驟一中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I (Ers-MIHl)基因的真核表達載體的構建(I)引物的設計；(2) PCR 反應；⑶TA克隆；(4)質粒提取；(5)酶切連接轉化；(6)陽性克隆的鑒定；(7)重組質粒的鑒定；步驟二 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I(Ers-MIHl)基因的真核表達。(I)貯存液的配制；(2)培養基的配制；(3)菌種的復蘇;(4)質粒的提取；(5)重組質粒pPIC9-MIHl和pPIC9的線性化；(6)酵母感受態細胞的制備；(7)MIHl基因的電轉化；(8)酵母轉化菌的鑒定；(9)MIHl表達陽性克隆的篩選；(10)最佳誘導時間的確定；(11)篩選菌株的SDS-PAGE檢測；(12)重組MIHl的大規模誘導表達。3.有益效果(I)本專利技術選擇較常用的PPIC9作為真核表達載體，畢赤酵母表達載體的多克隆位點位于醇氧化酶基因-I (alcohol oxidasel, A0X1)的啟動子(PAOXl)的下游，外源基因MIHl克隆至多克隆位點后，Paoxi可啟動外源基因的表達。(2)為了使表達的蛻皮抑制激素與天然蛋白質氨基酸序列一致，本研究設計了一對引物，直接將目的基因連接在信號肽編碼序列下面，除掉了信號肽切割位點與多克隆位點之間一段序列，使酵母表達的外源蛋白質MIHl經KEX2蛋白酶切割信號肽后得到成熟的中華絨螯蟹脫皮抑制激素蛋白；同時為了便于利用Ni-NATHis. Bind樹脂(Novagen)純化表達的MIHl重組蛋白，在下游引物的終止密碼子前加了 I個6-His編碼區段。重組質粒 PPIC9-MIH1的成功構建為進一步的酵本文檔來自技高網...
【技術保護點】
中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達方法，其步驟包括為：步驟一：中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達載體的構建：(1)引物的設計，根據中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的成熟肽編碼區cDNA序列和質粒pPIC9的多克隆位點設計一對PCR引物，其中上游引物包含1個Xho?I、l個KEX2蛋白酶識別位點和MIH基因的前15個核苷酸序列，箭頭位置為酵母α因子信號肽的切割位點，下游引物包含MIH基因編碼區的最后15個核苷酸序列、1個6?His編碼區段、1個Not?I識別位點及一個翻譯終止密碼子；(2)PCR反應；(3)TA克隆；(4)質粒提取；(5)酶切連接轉化；(6)陽性克隆的鑒定，用PIC?MIH?L和PIC?MIH?R進行菌落PCR篩選陽性克隆；(7)重組質粒的鑒定，PCR產物電泳出現陽性條帶的克隆按照1：100的比例稀釋擴增，抽提質粒，按照引物設計的酶切位點做Xho?I和Not?I雙酶切鑒定；挑選雙酶切能出現陽性條帶的克隆，并送測序驗證，陽性菌落置于?20℃保種備用；步驟二：中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因的真核表達：(1)貯存液的配制；(2)培養基的配制；(3)菌種的復蘇，把已經鑒定為含陽性克隆重組質粒pPIC9?MIH1的保種克隆菌JM109及空載體pPIC9的保種菌株DH5α按照1：100轉入新的含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養液中37℃恒溫，22orpm搖床過夜；(4)質粒的提取，把過夜培養的菌液1000g離心5min收集細胞，用mini?BESTPlasmid?Purification?kit試劑盒抽提重組質粒pPIC9?MIH1和pPIC9，?20℃保存備用，取2μl質粒用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)重組質粒pPIC9?MIH1和pPIC9的線性化，用限制性內切酶BglI分別對質粒pPIC9?MIH1和pPIC9進行單酶切反應，使其線性化，酶切反應體系為： 10×Buffer?D?10μl，BglII?1μl，質粒40μl，補雙蒸水至100μl，37℃水浴反應2小時，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用未酶切的質粒pPIC9?MIH1和pPIC9做對照，將已經線性化的pPIC9?MIH1和pPIC9用1%的瓊脂糖凝膠電泳后，分別用凝膠回收試劑盒回收純化；(6)酵母感受態細胞的制備；(7)MIH1基因的電轉化；(8)酵母轉化菌的鑒定；(9)MIH1表達陽性克隆的篩選；(10)最佳誘導時間的確定，取BMGY/BMMY培養基誘導的一株重組酵母菌不同時段所取的誘導菌液1.5ml，4℃,12000rpm離心10min，上清液用0.75g硫酸銨沉淀，去上清液后，將沉淀與30μl?SDS樣品緩沖液混合，100℃煮沸5min，各取20μl上樣，Tricine?SDS?PAGE凝膠電泳檢測，考馬斯亮藍染色顯帶后，用凝膠成像系統分析，以確定最佳誘導時間；(11)篩選菌株的SDS?PAGE檢測；(12)重組MIH1的大規模誘導表達，步驟包括接種GS115/pPIC9?MIH1表達陽性克隆菌于10ml?BMGY培養基中，30℃，250rpm搖床振蕩培養36hr后，至OD600>3.0；按1%接種于1000ml?BMGY培養基中，30℃，250rpm搖床振蕩培養36hr后，無菌條件下5000rpm離心10min，棄上清；在菌體沉淀中加入200ml?BMMY培養基，振蕩混勻，繼續30℃，250rpm搖床振蕩培養培養；每隔24hr，取誘導菌液1.5ml，4℃，12000rpm離心10min保存上清液于?20℃待用，然后添加甲醇至終濃度為0.5%，共誘導4天；誘導結束時，分別取各菌株的誘導菌液1.5ml，4℃，12000rpm離心10min保存上清液于?20℃以備聚丙烯酰胺凝膠電泳；分析和蛋白印跡分析，將菌液4℃，8500rpm，離心10min，收集上清液。...
【技術特征摘要】
1 .中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達方法，其步驟包括為 步驟ー中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達載體的構建 (1)引物的設計，根據中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的成熟肽編碼區CDNA序列和質粒pPIC9的多克隆位點設計ー對PCR引物， 其中上游引物包含I個Xho 1、1個KEX2蛋白酶識別位點和MIH基因的前15個核苷酸序列，箭頭位置為酵母α因子信號肽的切割位點，下游引物包含MIH基因編碼區的最后15個核苷酸序列、I個6-His編碼區段、I個Not I識別位點及一個翻譯終止密碼子；(2)PCR 反應；(3)TA克隆； (4)質粒提取； (5)酶切連接轉化； (6)陽性克隆的鑒定，用PIC-MIH-L和PIC-MIH-R進行菌落PCR篩選陽性克隆； (7)重組質粒的鑒定，PCR產物電泳出現陽性條帶的克隆按照I:100的比例稀釋擴増，抽提質粒，按照引物設計的酶切位點做Xho I和Not I雙酶切鑒定；挑選雙酶切能出現陽性條帶的克隆，并送測序驗證，陽性菌落置于_20°C保種備用； 步驟ニ 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素I基因的真核表達 (1)貯存液的配制； (2)培養基的配制； (3)菌種的復蘇，把已經鑒定為含陽性克隆重組質粒PPIC9-MIH1的保種克隆菌JM109及空載體PPIC9的保種菌株DH5 α按照I :100轉入新的含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養液中37°C恒溫，22orpm搖床過夜； (4)質粒的提取，把過夜培養的菌液IOOOg離心5min收集細胞，用miniBESTPlasmidPurification kit試劑盒抽提重組質粒pPIC9_MIHl和pPIC9，_20°C保存備用，取2 μ I質粒用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測； (5)重組質粒pPIC9-MIHl和pPIC9的線性化，用限制性內切酶BglI分別對質粒PPIC9-MIH1和pPIC9進行單酶切反應，使其線性化，酶切反應體系為10XBuffer D10 μ 1，BglII I μ 1，質粒40 μ 1，補雙蒸水至100 μ 1，37°C水浴反應2小時，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用未酶切的質粒PPIC9-MIH1和pPIC9做對照，將已經線性化的pPIC9-MIHl和pPIC9用1%的瓊脂糖凝膠電泳后，分別用凝膠回收試劑盒回收純化； (6)酵母感受態細胞的制備； (7)MIHl基因的電轉化； (8)酵母轉化菌的鑒定； (9)MIHl表達陽性克隆的篩選； (10)最佳誘導時間的確定，取BMGY/BMMY培養基誘導的ー株重組酵母菌不同時段所取的誘導菌液I. 5ml, 40C，12000rpm離心lOmin，上清液用O. 75g硫酸銨沉淀，去上清液后，將沉淀與30 μ I SDS樣品緩沖液混合，100°C煮沸5min,各取20 μ I上樣，Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測，考馬斯亮藍染色顯帶后，用凝膠成像系統分析，以確定最佳誘導時間； (11)篩選菌株的SDS-PAGE檢測； (12)重組MIHl的大規模誘導表達，步驟包括接種GS115/pPIC9-MIHl表達陽性克隆菌于IOml BMGY培養基中，30°C，250rpm搖床振蕩...
【專利技術屬性】
技術研發人員：殷文莉，戴建華，周開亞，
申請(專利權)人：殷文莉，
類型：發明
國別省市：
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