本發明專利技術公開了兩個對蝦新型表達載體構建方法。本發明專利技術通過設計基因特異性引物，以對蝦WSSV病毒為模板，擴增早期基因啟動子IE1不同長度片段IE（-94/+52）和IE（-945/+52）；利用限制性酶切及連接的方法，以IE（-94/+52）和IE（-945/+52）替換真核表達載體pcDNA3.1-GFP的CMV啟動子，構建了含對蝦病毒啟動子的兩個新型表達載體pcDNA3.1-IE（-94/+52）-GFP、pcDNA3.1-IE（-945/+52）-GFP。將構建好的表達載體與陽離子脂質體轉染試劑TransLipidTM混合肌肉注射對蝦，結果證明兩種表達載體均能在對蝦體細胞良好表達，同時宿主對蝦沒有呈現任何明顯的毒害作用。因此，這兩種表達載體可望用于對蝦口服疫苗或者對蝦細胞生物學的研究。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及對蝦細胞分子生物學研究以及對蝦抗病藥物開發領域，具體是。
技術介紹
凡納濱對奸(Litopenaeus vannamei)在我國海水養殖業中占有極為重要的地位。然而，由于對蝦病毒的廣泛傳播，每年給對蝦養殖業造成數百億元的經濟損失，嚴重影響對蝦養殖業可持續發展。雖然目前在對蝦病原診斷技術方面已取得了較大進展，但是在病毒防治方面仍然沒有很好的解決辦法。對蝦抗病毒藥物尚處在研究階段，主要研究方向有亞單位疫苗、核酸疫苗、卵黃抗體、中草藥等，其中，在亞單位疫苗方研究報道較多，VP28蛋白 已在家蠶蛹、昆蟲細胞、畢赤酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等不同宿主表達系統內表達，通過腹肌注射或口服途徑，發現表達產物對日本對蝦、斑節對蝦、克氏原螯蝦等具有提高免疫力和抗WSSV感染的作用。孟小林等將WSSV衣殼蛋白基因克隆到表達載體pcDNA3. 1，獲得重組表達載體pcDNA-VP28,該表達載體轉化沙門氏菌(Salmonella typhimurium)后經口服途徑進入對蝦體內，并使對蝦產生了對WSSV的抗病力。攻毒實驗表明，口服基因工程菌后第7、15、25天的保護率分別達到83. 3%、66.7%、56. 7%，基因工程菌經口服進入對蝦腸道后可存活7-10天，同時宿主對蝦沒有任何明顯的毒害作用。啟動子是基因(gene)的一個組成部分，控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。啟動子(Promoters)就像“開關”，決定基因的活動。啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉錄(transcription)因子的這種蛋白質(proteins)結合而控制基因活動的。轉錄因子就像一面“旗子”，指揮著酶(enzymes) (RNA聚合酶polymerases)的活動。這種酶制造著基因的RNA復制本。對蝦病毒WSSV有三個早期啟動子(IEl、IE2、IE3)，其中IEl的啟動能力最強，它在整個病毒感染周期均起作用。有研究證明，IEl啟動子在昆蟲細胞Sf9具有很強的活性，后者被用于WSSV基因在各細胞期的表達研究，盡管Sf9是WSSV非易感性細胞。IEl有一個Cys2/His2型鋅指結構，是啟動子活性的特征性部件。Fang He等用IE啟動子構建表達流感病毒HA基因的重組桿狀病毒載體，宿主細胞為Sf9。研究發現相對于CMV啟動子，IE啟動子控制下的重組桿狀病毒在細胞中的表達能力得到增強。王煜等為了比較不同啟動子在桿狀病毒/昆蟲細胞中的活性，利用IEl啟動子及其截短的m IEl啟動子、桿狀病毒ETL啟動子及其加長的mETL啟動子以及桿狀病毒多角體啟動子Pph構建了含有不同啟動子控制下的EGF P報告基因的重組桿狀病毒，分別感染S f9昆蟲細胞，利用流式細胞術檢測報告基因的表達水平。結果表明，WSSV的IEl啟動子和桿狀病毒的m E T L啟動子在昆蟲細胞S f 9細胞中都具有較強而早的啟動子活性，能夠控制報告基因早期高效表達，而Pph在感染后期才表現較強活性。pcDNA3. I-GFP是一個真核表達載體，其啟動子為CMV啟動子。該載體可以在多種哺乳動物(人、豬、小鼠等)細胞以及非哺乳動物(魚、昆蟲等)細胞表達，因此被廣泛用于各種動物的細胞生物學研究甚至疫苗的研發。目前尚沒有關于利用IEl啟動子對pcDNA3. I進行改造的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種。本專利技術解決上述技術問題的技術方案如下，操作步驟如下，其特征是兩個對蝦新型表達載體是雙鏈環狀DNA，是通過改造真核表達載體KDNA3. I獲得的，方法如下I.引物設計與合成參照GenBanK中WSSV基因組序列合成WSSV病毒早期基因啟動子IE (-94/+52)和IE (-945/+52)引物，見表I 表I引物Tab. IPrimer本文檔來自技高網...
【技術保護點】
兩個對蝦新型表達載體構建方法，其特征是兩個對蝦新型表達載體是雙鏈環狀DNA，是通過改造真核表達載體PCDNA3.1獲得的，方法如下：1）引物設計與合成：參照GenBanK中WSSV基因組序列合成WSSV病毒早期基因啟動子IE（?94/+52）和IE（?945/+52）引物，見表1：表1引物Tab,1Primer引物由華大基因生物工程有限公司合成；2）IE（?94/+52）和IE（?945/+52）的擴增：PCR反應采用25.0μL體系：WSSV?DNA模板2μL，2xPCR?mix?12.5μL，上下游引物(25μmol/L)各1μL，超純水8.5μL；IE（?94/+52）PCR反應程序：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃35sec，35個循環；72℃10min；IE（?945/+52）PCR反應程序：94℃5min；94℃30sec，51℃30sec，72℃35sec，35個循環；72℃10min；3)目的片段IE（?94/+52）和IE（?945/+52）的克隆與轉化：PCR產物按凝膠回收試劑盒說明進行目的片段回收后，與PEASY?T1克隆載體連接：PCR產物4μL，PEASY?T1克隆載體1μL,輕輕混合后，室溫放置10min，反應結束后將反應管置冰上，加連接產物于50μL?Trans1?T1化學感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激30sec，立即放冰上2min； 反應物加入500μL?LB培養液，37℃震蕩培養1h；取培養液200μL菌液涂布LA平板，37℃培養12小時；4)重組質粒PEASY?T1?IE（?94/+52）、PEASY?T1?IE（?945/+52）的鑒定：挑取上述LA平板上的單一細菌菌落，接種至500μLB培養液，37℃震蕩培養3h，取1μL菌液進行PCR鑒定，方法見PEASY?T1克隆載體試劑盒說明；5)序列測定與分析：將菌液PCR鑒定結果為陽性的菌液送華大基因測序，用DNAstar生物軟件對測序結果進行分析；6)pcDNA3.1?IE（?94/+52）?GFP以及pcDNA3.1?IE（?945/+52）?GFP表達載體的構建：用限制性內切酶SacI和Mlu?1分別酶切pcDNA3.1?GFP、PEASY?T1?IE（?94/+52）、PEASY?T1?IE（?945/+52），膠回收目的片段pcDNA3.1?GFP、IE（?94/+52）、IE（?945/+52）。將IE（?94/+52）、IE（?945/+52）分別與pcDNA3.1–GFP進行連接，連接方法：pcDNA3.1–GFP?2μL，IE（?94/+52）（或IE（?945/+52））10μL，T4DNA?Ligase?1μL，5×T4DNA?Ligase?Buffer?4μL，加水補足20μL，室溫連接10min，連接產物的轉化以及重組子的鑒定方法同上。...
【技術特征摘要】
1.兩個對蝦新型表達載體構建方法，其特征是兩個對蝦新型表達載體是雙鏈環狀DNA，是通過改造真核表達載體TCDNA3. I獲得的，方法如下 1)引...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黎銘，陳曉漢，馬春霞，謝達祥，趙永貞，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區水產研究所，
類型：發明
國別省市：
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