一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法技術

本發明專利技術涉及一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，采用雙層透氧材料嵌套組成中空透氧模具培養細菌纖維素，通過精確調節中空透氧模具內管內部壓力氣體與外管外部氣體的壓力以及氧氣體積濃度，使模具的內管與外管能夠沿徑向產生收縮/舒張的周期性交替變化。同時在培養液中加入可以緩慢釋放氧氣或糖源的緩釋微球，制備出一種管狀多孔細菌纖維素。本發明專利技術將細菌纖維素內部“有效區域”擴充一倍以上，縮短培養周期，使管狀細菌纖維素外壁更致密，提高材料的縫合性，降低了植入人體后在縫合處發生內膜增生與血栓的機率，形成的多孔結構有利于細胞、營養物質進入材料內部。本發明專利技術材料制備周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，特別是涉及一種具有多孔結構的管狀多孔細菌纖維素的制備方法。
技術介紹
細菌纖維素是指在不同條件下，能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種微生物合成的纖維素的統稱。醋酸菌屬中的木 醋桿菌Acetobacter xylinum由于產生纖維素效率最高而被廣泛用于細菌纖維素基礎研究以及應用研究的模板微生物。細菌纖維素的制備方法目前主要為靜態培養與動態培養兩種。由于菌種為革蘭氏陰性原生細胞體的賴氧生存屬性，使細菌纖維素形成于糖源與有氧區與的交界處。靜態培養得到的細菌纖維素材料根據培養容器形狀不同以及應用領域能夠形成薄膜狀，管狀等規則幾何形狀。在靜態培養過程中，嚴格要求不使培養容器產生劇烈晃動以避免細菌纖維素產生分層或部分黏連的現象，降低材料的應用價值。此外，靜態培養周期較長，成本過高，細菌纖維素產量無法滿足大規模生產的要求；動態培養是指在培養過程中，將氧氣或空氣以氣泡形式通入培養容器中并結合機械攪拌的方式，人為地使原本氧氣含量十分有限的培養液含有接近空氣中的氧氣含量，制備細菌纖維素。由于培養過程中存在著剪切應力，因此得到的細菌纖維素為絮狀、星形、團簇狀、球形、橢圓等不規則幾何形狀，應用價值不高。此外，有研究發現動態培養條件下會產生菌種細胞變異體，變異體不具有產生纖維素的能力，因此動態培養時間過久會抑制纖維素的產量。現有技術有報道利用先動態，后靜態的“兩步法”制備細菌纖維素，廣泛應用于東南亞地區“納塔”(椰果)產業。“兩步法”能夠在一定程度上提高單一靜態培養細菌纖維素的產量，但是從實質上說，仍然是兩種不同的制備工藝的簡單疊加，無法實現細菌纖維素材料既保證產量，又具有規整的幾何外形。現有技術采用透氧材料制成中空模具，利用菌種賴氧生存的生物特性，在模具內腔通入一定壓力的空氣或氧氣,置于接入菌種的發酵培養液中；或者將接入菌種的發酵培養液灌滿中空模具內部，將其置于一定壓力的環境中。靜置一段時間后，細菌分泌纖維素包覆模具外壁或緊貼模具內腔，形成異型中空材料。這種方法能夠獲得外形不局限于簡單的薄膜、管狀的異型中空細菌纖維素材料。需要指出的是，現有利用透氧材料人為創造氣/液界面，培養細菌纖維素材料存在培養周期長的缺陷。采用現有技術要使的細菌纖維素材料具有能夠滿足應用要求的力學性能，培養周期需要兩周甚至更長的時間。有研究認為，微生物形成細菌纖維素的關鍵在于其所處環境滿足有氧與有糖兩個條件。細菌纖維素內部由于上方空氣擴散作用而存在一個有氧區，同時由于下方培養液滲透作用而存在一個碳源區，處于有氧區與碳源區重疊區域，也稱為“有效區域”，的細菌才是真正產生纖維素的細菌，80%的纖維素來自于這部分細菌，因此也稱為“活性菌”。從實質上說，現有技術采用透氧材料制備細菌纖維素仍屬于靜態培養范疇，沒有將動態培養與靜態培養各自的優勢完全結合起來。現有技術將采用透氧材料制備得到的中空異型細菌纖維素應用于人造血管的構建，并已取得一定的成果。但是，僅依靠單層透氧材料制備得到的管狀細菌纖維素其有著內腔致密，外壁疏松的不對稱結構。疏松的外壁使得材料的縫合性能較差。在縫合處容易由于材料與周圍組織的順應性不夠而形成內膜增生，進而導致血栓的發生。
技術實現思路
本專利技術涉及一種管狀細菌纖維素的制備方法，采用雙層透氧材料嵌套的方式，構造出內外雙層氣/液界面，將細菌纖維素在培養過程中，內部有氧區與碳源區重疊區域為現有技術的兩倍，將制備周期由2周甚至更長時間縮短至10天以內。在現有公開技術的基礎上，本專利技術通過精確調節中空透氧模具內管內部壓力氣體以及外管外部氣體的壓力，使中空透氧模具的內管與外管都能夠沿徑向產生收縮/舒張，周期性的交替變化。由于中空透氧模具內管與外管的徑向收縮/舒張幅度很小，一般不超過5%，因此這種制備管狀細菌 纖維素的過程是一個“準靜態”的過程。不會因為徑向變化幅度過大而使材料產生物理分層或部分黏連的情況。通過調節中空透氧模具內管內部與外管外部的氧氣體積濃度，能夠控制材料內部纖維素的疏密程度，快速構筑出一個內腔致密光滑、外壁縫合性良好、沿徑向纖維素微纖絲取向規整的具備差異化結構的管狀細菌纖維素材料。同時，在靜置培養過程中，本專利技術在現有技術基礎上，將緩釋微球分散于接入菌種的發酵培養液中，一方面能夠使細菌分泌纖維素微纖絲并逐步形成纖維素network三維網狀結構的過程中將緩釋微球原位包覆在管狀細菌纖維素內部；另一方面，由于緩釋微球在靜置培養過程中能夠緩慢釋放內部包覆的過氧化物或細菌生物合成纖維素時所需要的碳源，因此靜置培養過程中，中空透氧模具內部的有氧區域不僅僅局限于內管與外管的表面，而是整個中空透氧模具的內部區域。這樣能夠大大提高細菌生物合成纖維素的效率，縮短培養周期。本專利技術采用生物相容性良好的明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原作為緩釋微球的囊壁材料，使緩釋微球在24 72小時內將內部物質釋放完畢后，能夠以溶解或降解的方式消失，形成管狀細菌纖維素內部的多孔貫穿結構。細菌纖維素(Bacterial Cellulose，也稱微生物纖維素)是一種納米纖維材料。其以細菌細胞內部作為生物合成反應器，將葡萄糖小分子在酶催化作用下經過一系列復雜的變構過程最終通過β -I, 4-糖苷鍵結合形成β -I, 4-葡萄糖鏈由細菌系細胞側面的催化位點擠出。β -I, 4-葡萄糖鏈彼此之間通過分子內與分子間氫鍵作用，逐步、分層地形成脂多糖層、類晶團聚體、纖維素微纖并最終形成纖維素。這一系列的細胞外(Extracellular)成形過程被稱為“纖維素的自組裝”。正是這個獨特的微生物參與的過程賦予了細菌纖維素良好的理化性能超細三維網狀結構；良好的吸濕、保濕以及透氣性能；超高的持水性與濕態強度；高抗張強度與彈性模量等等。大量研究表明細菌纖維素材料具有良好的體內、體外生物相容性，加上其優異的形狀可調控性與形狀維持性使其在構建體內、體外組織工程支架材料具有得天獨厚的優勢。本專利技術，采用中空透氧模具培養細菌纖維素，所述的中空透氧模具是由同軸的外管和內管嵌套組成，所述的外管內徑與所述的內管外徑差為I IOmm;所述的內管中通入壓力氣體，所述的內管外壁與外管內壁間充滿接入菌種的培養液和緩釋微球；所述的中空透氧模具外部為氣體。如上所述的，所述的中空透氧模具的內管與外管均由透氧材料根據所需修復的人體組織的實際形狀、直徑以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上與人體乳內動脈、隱靜脈、尿道、十二指腸或膽管的形狀一致。其中所述的透氧材料是指在常溫常壓下的氧氣透過速率為100 IOOOmL. m_2. s_S孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。所述的透氧材料是指通過針織、機織或編織的方法將棉、紗、聚乙烯纖維、聚丙烯纖維和/或PET纖維制成的中空多孔材料，或通過模具一次成型將硅橡膠、膨體聚四氟乙烯、乳膠或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。 所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。所述的緩釋微球為具有皮本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征是：采用中空透氧模具培養細菌纖維素，所述的中空透氧模具是由同軸的外管和內管嵌套組成，所述的外管內徑與所述的內管外徑差為1～10mm；所述的內管中通入壓力氣體，所述的內管外壁與外管內壁間充滿接入菌種的培養液和緩釋微球；所述的中空透氧模具外部為氣體。

【技術特征摘要】
1.一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征是采用中空透氧模具培養細菌纖維素，所述的中空透氧模具是由同軸的外管和內管嵌套組成，所述的外管內徑與所述的內管外徑差為I IOmm;所述的內管中通入壓力氣體，所述的內管外壁與外管內壁間充滿接入菌種的培養液和緩釋微球；所述的中空透氧模具外部為氣體。2.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的中空透氧模具的內管與外管均由透氧材料根據所需修復的人體組織的實際形狀、直徑以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上與人體乳內動脈、隱靜脈、尿道、十二指腸或膽管的形狀一致。3.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的透氧材料是指在常溫常壓下的氧氣透過速率為100 IOOOmLnT2. s—1，孔隙均一度偏差〈±0.3的材料。4.根據權利要求2或3所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的透氧材料是指通過針織、機織或編織的方法將棉、紗、聚乙烯纖維、聚丙烯纖維和/或PET纖維制成的中空多孔材料，或通過模具一次成型將硅橡膠、膨體聚四氟乙烯、乳膠或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。5.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的壓力氣體指內管中氣體壓力在設定下限與設定上限之間交替轉換的氣體，設定上限最大不超過I. 5個標準大氣壓，設定下限最小不低于I個標準大氣壓，轉換頻率為65 165次/分鐘，其中壓力氣體的氧氣體積濃度在10 100%范圍內。6.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的中空透氧模具外部的氣體指中空透氧模具外部的氣體壓力在設定下限與設定上限之間交替轉換的氣體，設定上限最大不超過I. 5個標準大氣壓，設定下限最小不低于I個標準大氣壓，轉換頻率為65 165次/分鐘，其中氣體的氧氣體積濃度在10 100%范圍內。7.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的接入菌種的培養液是指含菌種的發酵培養液；所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種；所述的緩釋微球為具有皮芯結構，外徑為50 250 Pm;其中，緩釋微球內部含有過氧化合物、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇；緩釋微球囊壁材料為明膠、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、殼聚糖或膠原；所述的緩釋微球在24 72小時內持續釋放緩釋微球內部物質，并在內部物質釋放完畢后的72小時內，緩釋微球囊壁以溶解或降解的方式消失。8.根據權利要求I所述的一種管狀多孔細菌纖維素的制備方法，其特征在于，所述的制備方法具體包括以下步驟 I)發酵培養液的調配； 發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05 0. 5，酵母膏0. 05 0. 5，檸檬酸0. 01 0. I，磷酸氫二鈉0. 02 0. 2，磷酸二氫鉀0. 01 0. I,余量為水； 發酵培養液的pH為4. 0 6. 0 ; 將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液； 2)菌種擴培； 將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2 X IO5 2 X IO7個/ml ; 3)靜置培養； 將擴培后的菌液與調配好的發...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊敬軒，李喆，鄭羿，王利群，王華平，陳仕艷，張云，
申請(專利權)人：東華大學，
類型：發明
國別省市：