本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于檢測(cè)Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）的檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)，應(yīng)用該方法可以對(duì)樣品中的Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確，快速的完成發(fā)酵乳制品，發(fā)酵食品以及人體腸道中益生菌Lactobacillus?casei?Zhang（CGMCC?1697）定性和定量測(cè)定。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種用于檢測(cè)Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)的檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)，應(yīng)用該方法可以對(duì)腸道中的Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確，快速的完成發(fā)酵乳制品，發(fā)酵食品以及人體腸道中益生菌Lactobacillus caseiZhang (CGMCC 1697)定性和定量測(cè)定。
技術(shù)介紹
Lactobacillus casei Zhang (CGMCC 1697)是從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫(kù)保藏的243株分離自自然發(fā)酵酸馬奶中的乳桿菌中優(yōu)選的I株具有優(yōu)良益生特性的乳桿菌。該菌株在消化系統(tǒng)中具有優(yōu)異的耐受胃酸、膽鹽和牛磺膽酸鈉水解能力。其具有乳桿菌共同的特性，即為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性、不液化明膠、無(wú)運(yùn)動(dòng)性、能在PH4. 5的BLB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)發(fā)育。L. casei ZhangCCGMCC 1697)屬同型乳酸發(fā)酵乳桿菌，葡萄糖發(fā)酵不產(chǎn)氣，經(jīng)EMP途徑只產(chǎn)生乳酸，且產(chǎn)生L-乳酸。能夠利用核糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、蕈糖、山梨醇以及七葉苷、水楊苷和甘露醇產(chǎn)酸，而不從阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、棉子糖產(chǎn)酸，不代謝乳糖或弱發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵鼠李糖。Lactobacillus casei ZhangCCGMCC 1697)菌株已經(jīng)在申請(qǐng)?zhí)枮?200610127362. 2、200710129939. 8的中國(guó)專利申請(qǐng)中公開(kāi)，在此將上述專利文獻(xiàn)公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容引入作為參考。進(jìn)一步經(jīng)16S rDNA 序列分析,表明 L. casei Zhang (CGMCC 1697)與 L. casei 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 334的同源性為100%。L. casei Zhang (CGMCC 1697)具有較強(qiáng)的抗人工胃液消化能力，在pH值為3. 0和PH值為4. 0的人工胃液中持續(xù)消化3h后其活菌數(shù)量不受影響，人工胃液消化后進(jìn)入人工腸液消化24h后，仍保持較高數(shù)量的活菌。L. casei Zhang (CGMCC 1697)對(duì)膽鹽具有極強(qiáng)的耐受性，能夠耐受介質(zhì)中膽鹽的最大濃度為I. 6g/100mL。L. casei Zhang (CGMCC 1697)在生長(zhǎng)過(guò)程中可以分解培養(yǎng)介質(zhì)中的牛磺膽酸鈉釋放出游離膽酸，對(duì)介質(zhì)中膽固醇的脫除量為74. 41mg/L，膽固醇降低率為49. 61%。用L. casei Zhang (CGMCC 1697)飼喂高脂血癥模型大鼠，可顯著降低血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C濃度，HDL-C濃度顯著升高。研究表明L. casei Zhang (CGMCC 1697)通過(guò)菌體對(duì)膽固醇的吸收吸附及減少肝腸循環(huán)中的膽酸來(lái)達(dá)到降血脂的功效。給小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697), L. casei Zhang (CGMCC 1697)菌株能夠在小鼠腸道內(nèi)定殖，并對(duì)病原菌具有拮抗作用。小鼠灌服L. casei Zhang (CGMCC 1697)可以顯著增加小鼠血清中IgG含量和腸粘膜SIgA含量，可以顯著提高小鼠外周血中⑶3+、⑶4+、⑶8+的比例，優(yōu)化了⑶4+/⑶8+比值，顯著上調(diào)血清中IFN-Y和IL-12含量，下調(diào)IL-Ia和TNF-a水平。這些結(jié)果說(shuō)明了 L. casei Zhang (CGMCC 1697)對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫及腸黏膜局部免疫具有調(diào)節(jié)功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明L. casei ZhangCCGMCC 1697)具有顯著抑制肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞株具有顯著的抑制作用。2007年，通過(guò)代謝調(diào)控的手段，完成了益生乳酸菌L. casei Zhang (CGMCC 1697)高密度發(fā)酵的小試和中試。200L發(fā)酵罐9次發(fā)酵發(fā)酵液中菌體密度平均可達(dá)2. 9X IOltlCfu/ml，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體后冷凍干燥可得到平均活菌數(shù)2. 65X10ncfu/g的菌粉，能夠滿足益生菌制劑和發(fā)酵劑對(duì)高活菌數(shù)的要求，已達(dá)到國(guó)際水平。為進(jìn)一步研究L. casei Zhang (CGMCC 1697)在高密度發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)和代謝機(jī)制，采用熒光定量PCR (quantitative PCR, q-PCR)技術(shù)研究了發(fā)酵過(guò)程中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)變化。分別于不同生長(zhǎng)階段和不同發(fā)酵條件下采集25組樣品提取RNA，對(duì)涉及糖代謝和酸耐受能力的16個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)分析，包括葡萄糖激酶(gk), ￠-葡萄糖苷PTS E II (pts),磷酸-絲氨酸結(jié)合蛋白磷酸化酶(psh-p),代謝調(diào)節(jié)蛋白CcpA(ccpa),磷酸果糖激酶(pfk),果糖二磷酸醒縮酶(pba),磷酸甘油酸激酶(pgk),烯醇化酶(enolase),丙酮酸激酶(pk),乳酸脫氫酶(ldh), NAD依賴型醇脫氫酶(nad)、 FlFO-ATPase (atp), Malolactic enzyme (mal), citrate lyase (cit);大分子修復(fù)蛋白基因Gr0el，dnak。這些關(guān)鍵酶基因在發(fā)酵過(guò)程中的表達(dá)變化情況的研究為后續(xù)從分子水平深入研究乳酸菌的生長(zhǎng)代謝調(diào)控機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)也為乳酸菌高密度發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。10年前，當(dāng)人類基因組計(jì)劃順利完成時(shí)，整個(gè)科學(xué)界都為之轟動(dòng)一“生命密碼”已經(jīng)被破譯，人類對(duì)自己的認(rèn)識(shí)將愈發(fā)深刻。當(dāng)科學(xué)家以為人類所有問(wèn)題都將迎刃而解的時(shí)候，更多的事實(shí)卻悄悄的指向了一個(gè)被我們忽視的領(lǐng)域——腸道菌群。正常的人體內(nèi)存在大量的共生菌群，這些細(xì)菌大部分寄生在人的腸道中，超過(guò)1000萬(wàn)億個(gè)，是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍，其微生物基因數(shù)量約為300萬(wàn)個(gè)，大約是人類基因組基因數(shù)量的100多倍，如此海量的基因能夠幫助微生物適應(yīng)多變的環(huán)境，同時(shí)形成了與人體密不可分的互惠共生關(guān)系。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的組成影響著每個(gè)人的健康，如腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂與糖尿病、月巴胖癥、高血壓等代謝類疾病有關(guān)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同的人具有不同的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，飲食、藥物以及環(huán)境因素可以影響個(gè)體腸道菌群的組成。同樣，不同腸道微生物結(jié)構(gòu)和組成，也影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加工、能量平衡、免疫功能、胃腸道發(fā)育及其他多種重要的生理活動(dòng)。但是隨著研究的深入，服用益生菌后，益生菌在體內(nèi)的定植研究成為難點(diǎn)，怎樣錨定目的菌種，怎樣對(duì)目的菌種進(jìn)行定量研究從而確定其體內(nèi)定植數(shù)量是學(xué)者一直探索的問(wèn)題。傳統(tǒng)腸道菌群的研究是建立在純培養(yǎng)技術(shù)之上的，但這些方法耗時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，而且受到培養(yǎng)條件約束，并不能全面客觀的反映腸道菌群的真實(shí)情況。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為腸道菌群研的究提供了全新的方法和思維，特別是熒光定量PCR技術(shù)(Q-PCR)，提供了基于非培養(yǎng)的微生物定性定量研究技術(shù)。本專利技術(shù)以L. casei Zhang (CGMCC 1697)的全基因組序列中一段特異性片段為依據(jù)，設(shè)計(jì)了針對(duì)該菌株的特異性引物，使用該引物對(duì)目的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Q-PCR定量，可以快速準(zhǔn)確的完成L. casei Zhang (CGMCC 1697)的定性定量研究。采用本專利技術(shù)的PCR和Q-PCR方法，能夠?qū)z測(cè)樣品，例如包含益生菌的乳制品或食物、人體的消化道排泄物中本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種定性定量檢測(cè)L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的方法，包括如下步驟：（1）從檢測(cè)樣品中提取DNA,制備用于進(jìn)一步擴(kuò)增的模板DNA；（2）PCR擴(kuò)增，以L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的全基因組序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)如下引物序列：LcZ?F:tgagccgctatctgatagtctt；LcZ?R:ccgacgtaccagctcact，利用設(shè)計(jì)的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增模板DNA；（3）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，定性檢測(cè)樣品中的L.casei?Zhang（CGMCC?1697）；（4）通過(guò)q?PCR檢測(cè)樣品中L.casei?Zhang（CGMCC?1697）的數(shù)量。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種定性定量檢測(cè)L. casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，包括如下步驟(I)從檢測(cè)樣品中提取DNA，制備用于進(jìn)一步擴(kuò)增的模板DNA ；(2)PCR擴(kuò)增，以L. casei Zhang (CGMCC1697)的全基因組序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)如下引物序列LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ；LcZR:ccgacgtaccagctcact,利用設(shè)計(jì)的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增模板DNA ； (3)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，定性檢測(cè)樣品中的L. casei Zhang (CGMCC 1697)； (4)通過(guò)q-PCR檢測(cè)樣品中 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的數(shù)量。2.權(quán)利要求I所述的一種定性定量檢測(cè)L.casei ZhangCCGMCC 1697)的方法，其特征在于，包括如下步驟 (O從檢測(cè)樣品中提取DNA，制備用于進(jìn)一步擴(kuò)增的模板DNA 采用液氮凍融-CTAB法取I. Og樣品洗滌處理，將洗脫的菌體于I. 5mL離心管中，立即置于液氮中完全凍結(jié)，取出后放入65°C水浴中融化5min，反復(fù)凍融3次，加O. ImL 10%SDS和10. O μ L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒溫?fù)u床中200r/min搖動(dòng)2h，室溫下12000g離心IOmin,收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，上清液與等體積的氯仿于12000g離心IOmin,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中進(jìn)行酚氯仿抽提2次，經(jīng)O. I倍體積的醋酸鈉，I倍體積的冰異丙醇沉淀總DNA，然后70%乙醇洗滌沉淀2次，回溶備用； (2)PCR 擴(kuò)增 L. casei Zhang (CGMCC 1697)的特異性片段 擴(kuò)增引物具體序列為；LcZ F:tgagccgctatctgatagtctt ;LcZ R:ccgacgtaccagctcact; 擴(kuò)增體系 反應(yīng)體系 50μ L :10XPCR Buffer 5μ L,25mmol/L Mg2+ I. O μ L，2· 5mmol/L dN...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張和平，張家超，陳永福，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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